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1、1核受体共激活因子 AIB1 在子宫内膜癌组织中的表达及其意义【摘要】 目的 研究子宫内膜癌组织中核受体共激活因子（AIB1）mRNA 和蛋白质的表达及其意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）技术，检测 51 例子宫内膜癌、13 例不典型增生子宫内膜、15 例复合型增生子宫内膜、19 例单纯型增生子宫内膜和18 例正常子宫内膜组织中 AIB1 mRNA 表达；同时采用免疫组化技术检测 AIB1 蛋白的表达。结果 子宫内膜癌组织中 AIB1 呈过表达状态。内膜癌组织中 AIB1 mRNA 阳性表达率和相对表达水平明显高于增生子宫内膜组织及正常子宫内膜组织（2=11.025，F=6.9
2、30，P0.01 ） 。不典型增生子宫内膜组织中 AIB1 mRNA 阳性表达和相对表达水平高于复合性增生内膜组织和单纯性增生内膜组织（2=6.133，F=4.213，P0.05） 。内膜癌组织中 AIB1 蛋白阳性表达率明显高于增生内膜组织和正常子宫内膜组织（2=13.546，P0.01 ） 。子宫内膜癌组织、异常增生内膜组织及正常子宫内膜组织间 AIB1 蛋白表达强度不同，三者间比较差异有显著性（H=6.023,P0.05)，但与肿瘤组织的肌层浸润深度及 ER蛋白表达有关2（2 =4.832、4.674，t=2.201、2.362,P0.05） 。结论 AIB1过表达发生在子宫内膜癌的早期
3、和癌前病变阶段，过表达的 AIB1可能在子宫内膜癌癌变发展过程中发挥作用。 【关键词】 子宫内膜肿瘤 核受体共激活因子 逆转录聚合酶链反应 ABSTRACT ObjectiveTo observe the expression of nuclear receptor coactivator AIB1 in endometrial carcinoma and to analyze its significance.MethodsAIB1 expressions were assessed via semiquantitative reverse transcriptionpolymerase c
4、hain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry in tissues of normal endometrium (n=18), hyperplasia endometrium (n=47) and endometrial carcinoma (n=51).ResultsThe expression rate of AIB1 mRNA in endometrial carcinoma was significantly higher than that in hyperplastic and normal endometrium (2=11.025
5、，F=6.930，P0.01). The expression of AIB1 mRNA in atypically hyperplastic endometrium was significantly higher than that in complex/simple hyperplasia (2=6.133，F=4.213，P0.01). The expression of AIB1 in endometrial carcinoma was significantly higher than that in hyperplastic and normal endometrium (2=1
6、3.548，P0.05), but related to the depth of myometrial infiltration（2 =4.832，4.674;t=2.201,2.362;P0.05).ConclusionOverexpression of AIB1 occurs in endometrial carcinoma at the early stage of the disease which might play an important role in carcinogenesis of endometrial carcinoma. KEY WORDS endometria
7、l neoplasms; nuclear receptor coactivator; reverse transcriptase polymerse chain reaction 子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。大约 80%子宫内膜癌的发生与雌激素有关，且已公认它是一种通过雌激素受体发挥作用的激素依赖性肿瘤。越来越多的研究显示，雌激素受体（ER）阳性与肿瘤的分化程度有关，ER 状态是反映子宫内膜癌细胞对内分泌治疗、放疗和化疗应答的重要预测指标15 。由此可见，雌激素雌激素受体的信号传导通路是子宫内膜癌治疗和预防的重要靶位点，而涉及该通路的重要元件核受体共调节蛋白因子亦首当其冲地成为目前研
8、究的重点。本研究针对目前国外研究比较集中且具有代表 性的核受体共激活因子（AIB1 ） ，通过采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）和免疫组化方法技术，分别检测子宫内膜癌、增生子宫内膜和正常子宫内膜组织标本中 AIB1 mRNA 和蛋白的表达情况，并结合临床病理特征，探讨其在子宫内膜癌组织中表达的意义。 41 材料与方法 1.1 材料来源 2003 年 10 月2004 年 12 月，青岛大学医学院附属医院妇科收治的子宫内膜癌病人手术标本 51 例。病人年龄 3275 岁，平均45 岁；根据子宫内膜癌手术病理分期： 期 34 例, 期 11 例， 期 6 例；组织学分级：G126 例，G215
9、 例，G310 例；组织学类型：子宫内膜样腺癌 41 例，其他病理类型 10 例。另取同期 18例子宫颈原位癌行子宫切除术的正常子宫内膜标本，以及门诊行分段诊刮病人内膜组织标本，其中 19 例为单纯性增生、 15 例为复合性增生及 13 例为不典型增生。所有病人在取标本之前均未接受放射治疗、化学药物治疗及性激素治疗。切除组织均经病理学证实诊断，子宫内膜癌手术病理分期按照 FIGO（1988 ）标准，组织学分级按照 WHO 标准，增生性子宫内膜按照 WHO(1994)分类。 1.2 标本收集与处理 新鲜标本离体后，取 1.5 g 立即置于-70 冰箱保存，同时取材以 40 g/L 甲醛固定，用于
10、病理诊断和免疫组化检测。 1.3 实验方法 1.3.1 RTPCR技术检测 AIB1 mRNA 的表达组织总 RNA 提取及 cDNA 合成：总 RNA 提取参照 TRIzol 试剂盒 (美国 GIBCOBRL公司产品)说明书中一步法进行。cDNA 合成参照反转录试剂盒 (美国 PROMEGA 公司产品 )说明书进行。 PCR 反应：参照文献1 3设计 PCR 引物。AIB1U primer 上游引物序列为55ATACTTGCTGGATGGTGGACT3（positions 110130 ， GenBank accession no. AF012108)，AIB1L primer 下游引物序列
11、为 5TCCTTGCTCTTTTATTTGACG3（positions438458; GenBank accession no.AF012108)，扩增产物片断长度为 349 bp。内参照葡萄糖磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物序列为5AAGGTCGGAGTCAACGGATT3，下游引物序列为5CATGAGTCCTTCCACGATAC3,扩增产物片断长度为 513 bp。AIB1 的 PCR 扩增反应条件：95 预变性 5 min；95 变性45 s，53 复性 45 s，72 延伸 1 min，共 35 个循环；最后 72 延伸 10 min。产物分析：所有标本在 513 bp 处产生 GAP
12、DH 扩增条带，证明 RNA 提取和逆转录是成功的。10 L PCR 产物置于20 g/L 的琼脂糖凝胶(0.5 mg/L 溴化乙锭染色)上进行电泳，紫外线透照仪下观察并照相，扩增出 349 bp 和 513 bp 条带者为阳性表达。电子计算机图像分析仪(VIDAS 2.1 型德国 OPTON 公司产品)对目的基因及内参照图像进行积分吸光度（A）分析。本研究以AIB1/GAPDH 条带的吸光度比值代表 AIB1 mRNA 的相对表达水平。1.3.2 链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物连接（SP）法检测 AIB1蛋白 参考文献4 ，以乳癌 MCF7细胞涂片作为 AIB1 蛋白表达阳性对照。以磷酸盐缓冲
13、液(PBS)代替一抗作为阴性对照。AIB1 山羊抗人多克隆抗体购自美国 Santa Cruze 公司，SP 免疫组化染色试剂盒（SP9003 ）为北京中杉生物技术有限公司产品。实验步骤严格6按照说明书进行。免疫组化结果判断：细胞浆或细胞核内出现棕黄色颗粒者判断为阳性细胞。AIB1 蛋白阳性染色大部分以胞浆为主，部分胞核染色；阳性判断采用 Sinicrope 改良法2。 1.4 统计学方法 应用 SPSS 11.0 软件进行统计学分析。计量资料比较采用 t 检验、方差分析和 q 检验，计数资料比较采用 2检验和 H 检验。 2 结 果 2.1 AIB1 mRNA 在正常子宫内膜、增生子宫内膜及子
14、宫内膜癌中的表达 正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中均可检测到 AIB1 mRNA 的表达（图 1） 。正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌 3 组不同子宫内膜组织 AIB1 mRNA 阳性表达率比较，差异有显著性（2=11.025,P0.01） ；3 组不同子宫内膜组织AIB1 mRNA 的相对表达水平比较，差异有显著性（F=6.930,P0.01 ） ，子宫内膜癌组织中 AIB1 mRNA 相对表达水平高于正常子宫内膜和异常增生子宫内膜组织（q=4.682 、3.909,P0.01） 。单纯性增生、复合性增生及不典型增生内膜组织中 AIB1 mRNA 阳性表达率比较，差
15、异有显著意义（2=6.133，P0.05） ；三者间 AIB1 mRNA 相对表达水平比较，差异有显著意义（F=4.213，P0.05）,不典型增生内膜组织AIB1 mRNA 相对表达水平高于单纯性增生和复合性增生内膜组织（q= 3.848、4.464,P0.01 ） 。见表 1。表 1 不同类型子宫内膜7组织中 AIB1 mRNA 表达比较分 2.2 AIB1 蛋白在正常子宫内膜、增生子宫内膜及子宫内膜癌中的表达 AIB1 蛋白阳性染色主要位于腺上皮细胞及癌细胞的胞浆内，呈黄褐色弥漫性分布，少数为细胞核染色（图 2） 。正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中 AIB1 蛋白阳性表达率比较，差异有显著性（2=13.546，P0.01 ） ；3 组不同子宫内膜组织AIB1 蛋白的表达强度比较，差异有显著意义（H=6.023，P0.05 ） ，子宫内膜癌组 AIB1 蛋白表达强
