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1、1染锰大鼠脑匀浆生化分析作者：吴燕明，张德兴，贺新红，陆志根 【摘要 】 目的 了解锰对脑组织相关酶类活性的影响及可能的细胞保护机制。方法 大鼠经饮水连续染锰（MnCl24H2O 0.5 g/L和 5.0 g/L）60 d 后, 应用荧光光度比色法测定新鲜脑组织匀浆的谷丙转氨酶（ALT ） 、谷草转氨酶（AST） 、碱性磷酸酶（ALP） 、胆碱酯酶（ChE） 、单胺氧化酶（MAO） 、氧化亚氮合酶（NOS） 、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH） 、丙二醛（MDA ） 、蛋白质（PRO）含量,并设生理盐水对照组。 结果 与对照组比较，高、低剂量组的 ALT、AST、ALP、ChE、
2、MAO 、NOS 活性和MDA 含量明显升高；而 SOD 活性和 GSH 含量则显著降低。 结论 过量锰沉积可影响脑组织多种酶类的正常代谢，对脑组织造成毒性损害。 【关键词】 锰；脑组织；酶；毒性；生化分析 Abstract:Objective To study the effects of manganese on enzymes and possible cellular defense mechanism. Methods Male SD rats were given drinking water containing manganese chloride (MnCl24H2O 0.5
3、 g /L and 5.0 g/L respectively) for 60 days. At the end of experiment, all the rats of the manganeseexposed groups and control group 2were decapitated after anaesthesia with 2% sodium phenobarbitone intraperitoneally, the brains were removed and activities of alanine aminotransferase（ALT）, aspartate
4、 aminotransferase（AST）, alkaline phosphate（ALP ）, cholinestarase（ChE）, monoamine oxidase（MAO）, superoxide dismutase（SOD）, nitric oxide synthase（NOS）, and levels of glutathione（GSH） ，maleic dialdehyde（MDA） ，and proteins were biochemically analyzed. Results Compared with the control group, activities
5、of ALT, ALT, ALP, ChE, MAO, NOS and MDA level increased, but the SOD activity and GSH level decreased significantly in 2 manganeseexposed groups. Conclusion Manganese induced toxic effects on brains in rats by interfering with the metabolism of related enzymes. Key words:manganese; brain; enzymes; t
6、oxicity 锰是中枢神经系统正常生理活动所必需的微量元素，但过量的锰可产生神经毒性，导致神经细胞不可逆性损害，临床多呈类帕金森氏综合征表现1,2 。透过血脑屏障的锰，有选择性地沉积在包括锥体外系结构在内的广泛靶区，靶区内神经元的线粒体则是其攻击的靶点3 。锰的神经毒性机制已经从神经元的能量代谢、自由基和巯基耗竭、DA 自氧化、兴奋性毒性、线粒体损伤等方面进行了研究，这其中涉及到神经细胞内多酶体系的代谢过程。本研究通过测定连续锰染毒大鼠脑匀浆中的谷丙转氨酶（ALT） 、谷草转氨酶3（AST） 、碱性磷酸酶（ALP ） 、胆碱酯酶（ChE ） 、单胺氧化酶（MAO） 、氧化亚氮合酶（NOS）
7、、超氧化物歧化酶（ SOD）活性和谷胱甘肽（GSH） 、丙二醛（MDA） 、蛋白质（PRO）含量等指标的变化，探讨锰对脑部神经细胞相关酶代谢的影响，为锰的神经毒性及其机制提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 二氯化锰（MnCl24H2O，分子量 197.91,分析纯,纯度不低于99.0%,天津市福晨化学试剂厂） ；ALT、AST、ALP、ChE、MAO、SOD、NOS、SOD 、GSH、MDA、PRO 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所） ；主要仪器：721 分光光度计（上海第三分析仪器厂） 、HH 恒温水浴箱（江苏金坛市金成教育仪器厂） 、802 EPPENDOF 离心机（北京安亭仪
8、器厂） 。 12 方法 121 动物处理 健康雄性 SD 大鼠 36 只，体质量 130150 g,广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤20030002） ，粤监证字 2006A015。随机分成 3 组，即对照组、低剂量染锰组和高剂量染锰组，每组 12 只，分笼饲养，光照时间为 12 h。染毒途径:采用饮用水中加入二氯化锰方式进行，即将氯化锰溶于蒸馏水中（新鲜配制） ，连续染毒 60 d，染毒剂量为低剂量染锰组 0.5 g/L、高剂量染锰组 5.0 g/L,对照组则供用蒸馏水。 4122 脑脏器系数的检测 于实验结束日，称体质量，经2%()戊巴比妥钠腹腔内麻醉（2 mL/kg 体
9、质量）后，立即断头、开颅、冰浴上取全脑，去除脑膜和血污，天平称量脑重。计算脑重/体质量比值（以每 100 g 体质量计算）作为脑的脏器系数。 123 全脑匀浆生化分析 取脑去膜称重后，即依照试剂盒提供的方法制成全脑匀浆，取其上清液，用 721 分光光度计（上海第三分析仪器厂）比色法分别测定 ALT（赖氏法） 、AST（赖氏法） 、ALP、 ChE、MAO、SOD（羟胺法） 、NOS 及 GSH、MDA（TBA法）和 PRO（考马斯亮蓝法）的含量。 1.3 统计分析 所有实验数据用(s)表示，采用 SPSS11.5 软件进行统计分析。用 Scheffs Test 方法进行组间均数比较,以 P0.
10、05） 。 22 锰脑匀浆 ALT、AST、ALP、ChE、MAO、SOD 、NOS活性及 GSH、MDA 和 PRO 含量的影响 三组大鼠脑匀浆的 PRO 含量无明显差异（P0.05 ）;5ALT、AST、ALP、ChE、MAO、NOS 活性及 MDA 含量低剂量组明显高于对照组，高剂量组又明显高于低剂量组；但 SOD 活性和GSH 含量低剂量组明显低于对照组，而高剂量组又明显低于低剂量组。见表 1。表 1 锰对大鼠脑匀浆ALT、AST、ALP、ChE、MAO、NOS、SOD 活性及 GSH、MDA和 PRO 含量的影响 3 讨 论 生物体内、外锰接触的研究均证实，体内过量的锰可透过血脑屏障
11、沉积于广泛脑区，对神经元造成不可逆性损害4,5 。锰对神经元的毒性机制之一，与影响神经细胞的能量代谢及胺类神经递质的合成与释放有关。锰对线粒体有特殊亲和力，大量的锰积蓄于线粒体内可抑制线粒体三羧酸循环、氧化磷酸化和呼吸链等一系列重要酶系，干扰能量代谢并妨碍脑组织儿茶酚胺代谢代程，导致 DA 能神经元变性和突触中介质传导功能紊乱6 。MAO 是 DA 降解过程中的限速酶，可催化单胺类物质氧化脱胺成为醛，DA 通过 MAO降解而失活。本研究结果显示，高、低剂量染锰组大鼠脑匀浆中MAO 活性明显高于对照组，提示锰在脑区的沉积激发了 MAO 活性的提高，是其导致脑 DA 神经元损伤的分子机制之一。 脂
12、质过氧化是锰毒性损伤作用的机制之一。有研究表明，锰引起生物膜不饱和脂肪酸过氧化作用增强，脂质过氧化产物生成增加，导致生物膜结构受损、功能紊乱，神经细胞变性死亡7 。MDA是脂质过氧化的代表性终产物，它的含量反映脂质过氧化损害情况6的细胞氧化应激程度；SOD 是需氧生物体内一种含不同金属元素的酶蛋白，是唯一可以消耗过氧化物自由基的酶，测定其活性可直接了解机体抗氧化能力水平；GSH 是网络抗氧化剂中最丰富的一种含硫基非蛋白质化合物，可保护含硫基的重要蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害。GSH 还是低分子清洗剂，可以清除超氧阴离子、过氧化氢、脂过氧自由基等。因此，GSH 含量的多少是衡量机体抗
13、氧化能力的又一重要指标。本研究结果中，与对照组相比，高、低剂量组大鼠脑匀浆的 MDA 明显升高，而 SOD、GSH 则显著下降，揭示锰抑制了 SOD 活性和 GSH 对自由基的清除作用，导致了过氧化产物的堆积，引发神经细胞的损害。 锰通过 NO 介导的神经毒性近年特受关注。姜岳明等8 研究证明，锰能诱导 NOS 合成，引起内源性 NO 大量增加。过量的 NO 是一种细胞毒分子，可通过干扰能量代谢，抑制 ATP 合成等途径，造成组织细胞的变性坏死；Jacinth 等9的研究揭示，体内过量的 NO 还可通过以下机制损伤 DNA：致 DNA 碱基脱氨基、致 DNA 氧化、致亚硝氨含量增加、抑制 DN
14、A 损伤的修复。本研究结果中，高、低剂量染锰组的 NOS 均比对照组明显升高，这为锰通过 NO 介导的神经毒性分子机制提供了进一步的证据。 【参考文献】 1DORMAN D C, STRUVE M F，JAMES R A, et al. Influence of particle solubility on the delivery of inhaled manganese to the rat brain: manganese sulfate and 7manganese tetroxide pharmacokinetics following repeated (14day) exposu
15、resJ . Toxicol Appl Pharmacol, 2001,170:78. 2 贺新红,张德兴. 锰接触对新生大鼠脑发育的时空影响因素研究J. 卫生研究,2005,34(2):161. 3 CHEN J Y，TSAO G C，ZHAO Q Q, et al. Differential cytotoxicity of Mn3+ and Mn 2+:special reference to mitochondrial FeScontaining enzymesJ. Toxicol Applied Pharmacol, 2001,175:160. 4 NICOTRA A，PARVEZ S H. Apoptotic molecules and MPTP-induced cell deathJ. Neurotoxicol Tereatol, 2002,24(5):599. 5 黄国香，宋世震锰的神经毒性机制与基因调控J. 中国工业医学杂志，2007，20（27）：113 6 MALECKI E AManganese toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and DNA fragmentation in
