《构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab》由会员分享，可在线阅读，更多相关《构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1构建预设 CDR3 基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素3mAb的人源化 Fab作者：王臣 侯利华 杜桂鑫 李建明 陈溥言 童贻刚【关键词】 噬菌体抗体库;,整合素 3;,人源化 FabAbstract AIM: To construct phage antibody library with predetermined CDR3 and to screen humanized Fab of antihuman integrin 3 monoclonal antibody (mAb) by epitope guided selection. METHODS: LCDR3 gene of mAb E
2、10 was inserted into human light chain variable region gene library. Hybrid phage antibody library was constructed by cloning E10 chimeric Fd gene and human light chain variable region gene into pComb3. Humanized light chain gene was obtained by screening against human integrin 3. Likewise, humanize
3、d Fab were gained by panning human phage antibody library, which was constructed by cloning humanized light chain gene and human heavy chain Fd gene with E10 HCDR3 into pComb3. RESULTS: Three humanized Fab clones was obtained by screening hybrid phage antibody library and human phage antibody librar
4、y, which contained 22.1106, 2107 colony forming units, respectively. Indirect ELISA and competitive inhibition ELISA analysis demonstrated that three humanized Fab antibody had specific binding activity with human integrin 3. The strongest antihuman integrin 3 reactive D5 clone was sequenced and seq
5、uencing analysis showed that the V and VH were derived from VKIII and VHI, respectively. CONCLUSION: Humanized Fab of antihuman integrin 3 mAb has been successfully obtained by phage display technology which lays the foundation for further clinical research.Keywordsphage antibody library; integrin 3
6、; humanized Fab摘 要 目的: 构建预设 CDR3 基因的噬菌体抗体库, 通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素 3 单克隆抗体(mAb)人源化 Fab。方法: 将鼠 mAb LCDR3 重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链 Fd 基因配对构建杂合噬菌体抗体库, 用固相人整合素 3 抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠 mAb HCDR3 的人重链 Fd 基因配对构建人源噬菌体抗体库, 筛选人源化 Fab。结果: 分别构建了库容为 2.1106 和 2107 的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库, 筛选到 3 株人源 Fab 克隆。3经间接 ELISA 及竞
7、争抑制 ELISA 证实, 能特异结合整合素 3 抗原, 其中人源 D5 株 Fab 克隆的基因序列表明, 人轻链可变区基因属VKIII 亚群, 人重链可变区基因属 VH1 亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术, 成功地进行了鼠抗人整合素 3 mAb E10 人源化的改造, 为进一步临床应用奠定了基础。关键词噬菌体抗体库; 整合素 3; 人源化 Fab鼠源单克隆抗体(mAb)为人类疾病的研究起到了重大的推动作用, 但由于其应用于人体易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应, 严重限制了其临床应用。噬菌体抗体库技术作为抗体技术领域中的一项革命性进展, 该技术自建立之日起就得到了广泛应用。目前也被公认是制备
8、抗体的高效技术平台1, 2 。同时该技术也为鼠 mAb 的人源化提供了新的方法。Jespers 等3报道的抗原表位导向选择法的优越性, 在于其可获得和原来鼠 mAb 针对同一表位的完全人源抗体。王卓智等4曾运用该方法对抗 TNF 鼠 mAb 进行人源化, 但所获人源 mAb 的特异性和亲和力难以得到保证, 在实验中常常难以获得满意的人源抗体。Rader 等5利用上述抗原表位导向选择法构建了预设的抗体库, 经对抗整合素 3 鼠 mAb LM609 进行人源化改造, 取得了良好的效果。即先用鼠 Fd 片段基因与含有鼠mAb LCDR3 的人轻链基因配对构建杂合噬菌体抗体库, 筛选人源化轻链。然后再
9、用筛到的人源化轻链与含有鼠 mAb HCDR3 的人4Fd 基因配对构建人源抗体库, 筛选人源 mAb 基因。该方法对人抗体可变区基因文库进行了预设, 将原鼠 mAb 的 CDR3 基因预先重组到人可变区文库中。由于可变区的 CDR3 是决定抗体特异性的关键部位, 因而使可变区文库中模拟亲本鼠 mAb 的能力大大提高, 并易与筛到可与亲本鼠 mAb 形成理想配对的人可变区基因。本研究中, 我们利用抗原表位导向选择方法, 对 1 株抗人整合素 3 鼠mAb E10 进行了人源化改造, 成功地筛选到 3 株人源化 Fab 片段。1 材料和方法1.1 材料 噬菌粒 pComb3、 大肠杆菌 XLIB
10、lue 及辅助噬菌体 VCSM13, 均为本室保存。含人源抗 HBsAg 抗体轻、 重链全长基因的双表达质粒 B4HFLF 为本室构建。抗人整合素 3 杂交瘤细胞株 E10 及抗人整合素 3 鼠 mAb（效价 12 000）由军事医学科学院基础医学研究所孙启鸿研究员惠赠。抗人整合素 3单链抗体(scFv)和鼠人嵌合 Fab 噬菌体抗体由本室构建和表达 6, 7 。人整合素 3 蛋白购自美国 Chimcon 公司。HRP 标记的抗VCSM13 mAb 及淋巴细胞分离液 FicollPaqueTM PLUS, 购自Amersham Pharmacia 公司。人脐带静脉血取自解放军 301 医院。1
11、.2 方法51.2.1 RNA 提取及 PCR 扩增 取人胎盘脐带静脉血 100 mL, 用淋巴细胞分离液 FicollPaqueTM PLUS 分离人淋巴细胞, 并按TRIzol Regent 试剂盒的说明书提取细胞总 RNA, 依试剂盒制备cDNA。引物参照文献 5, 8设计, 稍作改动。具体引物序列可参阅文献9 。PCR 扩增人抗体 VH 及 VL FR1FR3 基因的条件为: 94变性 15 s, 52 退火 20 s, 72延伸 60 s, 共 30 个循环。1.2.2 含鼠 mAb CDR3 的人轻链和 Fd 基因库的构建 以B4HFLF 载体为模板, 用引物 CR501 及 CR
12、301 扩增人 VHFR3 鼠HCDR3 人 VHFR4CH1 基因片段。分别以引物 CR5、 CR5 与CR3 配对, 扩增人 V FR3 鼠 LCDR3 人 V FR4C 和人 VFR3鼠 LCDR3 人 V FR4C 基因。将所获基因片段 , 分别与上述 PCR扩增的各种组合人抗体 VH 及 VL FR1FR3 基因逐个配对相互融合。重链 Fd 基因融合的 PCR 条件为: 取人 VHFR3 鼠 HCDR3 人VHFR4CH1 基因及人抗体 VHFR1FR3 基因各 15 ng 为模板, 分别以 VH sense primers 和 CR301 为引物于 94 变性 20 s, 55 退
13、火 20 s, 72延伸 60 s, 共 25 个循环。分别将各种引物组合所扩增的融合 PCR 产物混在一起即为构建的含鼠 HCDR3 的人重链 Fd 基因库。轻链融合条件同上类似于扩增 链及 链的 PCR 产物, 混合后即为构建的含鼠 mAb LCDR3 的人轻链基因库。具体操作过程可参照文献9 。61.2.3 噬菌体抗体库的构建及鉴定 本研究分别要构建鼠人嵌合 Fd 人轻链杂合噬菌体抗体库及人源噬菌体抗体库。杂合抗体库的构建: 将鼠人嵌合 Fd 基因和人轻链基因库分别经 Xho I/Spe I、 Sac I/Xba I 双酶切后, 重组到噬菌粒 pComb3 载体中。以其电转化大肠杆菌,
14、经辅助噬菌体超感染后收集上清即为噬菌体抗体库。人源抗体库构建原理与此相同。噬菌体抗体库的构建及鉴定具体操作过程参照文献10 。1.2.4 噬菌体抗体库的筛选及单克隆噬菌体抗体的制备 参照文献11, 以 8.7 mg/L 的人整合素 3 蛋白包被酶联板, 于4过夜。加含 30 g/L 的 BSA 的 PBS 于 37封闭 1 h, 洗板后加100 L 噬菌体抗体库(约 1012cfu), 于 37 2 h。以 TBST 洗 1 次(第 2 轮洗 5 次, 第 3 轮后洗 10 次, 每次 5 min), 加 100 L 洗脱液（0.1 mol/L 盐酸, 甘氨酸调 pH 至 2.2, 加 BSA
15、 至 1%）回收噬菌体, 经 3 mL 中和缓冲液 (2 mol/L Tris)调节 pH 至中性后感染 2 mL细菌, 进行下一轮筛选 , 共进行 4 轮筛选。从第 3 轮和第 4 轮淘筛后, 铺平板培养后, 各挑取 20 个单个菌落接种于 2 mL SB 培养基中, 于 37培养至 A6000.50.6 。加 20 L VCSM13, 于 37培养2 h 后, 补加卡那霉素至 70 mg/L, 过夜培养, 次日收集上清即为噬菌体抗体。1.2.5 噬菌体抗体的抗原结合活性 用 50 L 的人整合素73 抗原包被酶联板于 4 过夜。以 100 g/L 脱脂奶粉封闭 2 h 后, 将上述噬菌体抗
16、体与等量脱脂奶粉混合, 室温放置 30 min 加入到封闭后的孔内, 每孔 50 L, 于 37孵育 2 h。用 PBST 洗板 3 次, 加入 HRP 抗 M13 抗体, 于 37 放置 1 h。以 PBST 洗板 3 次, 加入 TMB 显色 10 min（加 A 液后再加 B 液各 1 滴）, 用 50 L 2 mol/L H2SO4 终止反应, 用酶标仪测定 A450 值。检测中以辅助噬菌体 VCSM13 作为阴性噬菌体抗体对照。1.2.6 噬菌体抗体的交叉反应性 取噬菌体抗体阳性的克隆与不同抗原 BSA、 HBsAg、 木瓜蛋白酶和小鼠 IgG 进行交叉结合活性鉴定。即以各种抗原包被酶联板后, 其余步骤同间接 ELISA。
