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1、3 2 月季的花药培养 一 被子植物的花粉发育 花丝 花药 一 被子植物的花粉发育 一 被子植物的花粉发育 小孢子 母细胞 4个小孢子 四分体时期 4个小孢子 单核居中期 4个小孢子 单核靠边期 花粉粒 双核期 花粉母细胞 单核花粉营养细胞 生殖细胞 精子 被子植物的花粉发育 雄蕊 花丝 花药 囊状结构 内有很多花粉粒 花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的 因此 花 粉是单倍体的生殖细胞 花粉的发育要经历 四分体时期 单核期 双核期 注意 二核花粉粒 成熟的花粉粒中 只含花粉管细胞核和生殖细 胞核 精子在花粉管中形成 三核花粉粒 有些植物的花粉 在成熟前 生殖细胞进行一 次有丝分裂 形成两个
2、精子 这样的花粉在成熟时 含有一个 营养核和两个精子 两个精子和一个营养核的基因型相同 1花粉母细胞4个小孢子 减分 有分 4个花粉管细胞核 4个生殖细胞核 有分 8个精子 实例一 关于被子植物花粉发育的说法 不正确的是 A 花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的 B 被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果 C 被子植物的花粉的发育要经历四分体时期 单 核期 双核期等阶段 D 花粉粒在发育过程中 核先位于细胞一侧 再 移到细胞中央 花粉母细胞经减数分裂形成4个单核花粉粒 每个花粉粒 的细胞核进行一次有丝分裂形成1个花粉管细胞核和1个生 殖细胞核 每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成2个 精子 BD
3、二 产生花粉植株的两种途径 二 产生花粉植株的两种途径 花药 胚状体 愈伤组织 丛芽 移栽 丛芽 生根 二 产生花粉植株的两种途径 二 产生花粉植株的两种途径 移栽 花药中 的花粉 胚状体 脱分化 愈伤组织 花药中 的花粉 脱分化 分化 丛芽 再分化 丛芽 诱导 生根 愈伤组织 在人 工培养基上由外 植体长出来的一 团无序生长的薄 壁细胞 细胞排 列疏松 无规则 二 产生花粉植株的两种途径 二 产生花粉植株的两种途径 体细胞胚 胚状体 在组织培养过程中 某些体细胞在形 态上转变为与合子发育成的胚非常相似的 结构 发育过程亦与合子胚类似 被称为 体细胞胚 胚状体 体细胞胚 胚状体 花粉胚形成的小
4、植株 三 影响花药培养的因素 植物类型 生理状态 花期早期的花药反应能力较好 花粉发育时期 一般而言单核后期花药对培养 反应较好 影响花药培养的因素 主要的影响因素 材料的选择与培养基的组成 一 材料的选择 1 接种的花药时期 一般来说 在单核期 细胞核 由中央移向细胞一侧时 花药培养成功率最高 选择完 全未开放的花蕾 可挑选到单核期的花药 菌少 易消 毒 花瓣松动 菌多 消毒困难 2 此外 亲本植株的生长条件 材料的低温预处理 以及接种密度对诱导成功率都有一定的影响 二 培养基的组成 小麦中为N6 马铃薯 月季中为MS 油菜中 为B5培养基 为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难 花瓣松动后
5、微生物就可能侵入到花药 给材料的消毒带来困难 实验操作 一 材料的选取 二 材料的消毒 三 接种和培养 一 材料的选取 1 选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于 适宜的发育期 2 确定花粉发育时期最常用方法有醋酸洋红法 但是 某些植物的花粉细胞核不易着色 需采用焙花青 铬 矾法 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色 注 花粉细胞核内有染色体 染色体主要由DNA和蛋白 质组成 醋酸洋红为碱性染色剂 染色体容易被染色 通过染色 可以确定细胞核为单核期还是双核期 是单 核居中期还是单核靠边期 一般单核靠边期的花药培养 成功率最高 实验操作实验操作 一 材料的选取 1 1 醋酸洋红法 醋酸洋红法
6、醋酸洋红的配置醋酸洋红的配置 将体积分数将体积分数4545 的醋酸 的醋酸100ml100ml煮沸 缓缓加入煮沸 缓缓加入 1g1g洋红 在加热回流洋红 在加热回流8h8h 冷却至 冷却至5050 过滤 过滤 即可 即可 染色操作染色操作 将花药放在载玻片上 加一滴质量分数将花药放在载玻片上 加一滴质量分数1 1 的醋酸洋红 用镊柄将花药捣碎 盖上盖玻的醋酸洋红 用镊柄将花药捣碎 盖上盖玻 片在显微镜下检查 片在显微镜下检查 实验操作实验操作 一 材料的选取 2 2 焙花青 焙花青 铬钒法铬钒法 卡诺氏固定液的配制方法卡诺氏固定液的配制方法 将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积
7、比为3 3 1 1 的比例混匀的比例混匀 焙花青焙花青 铬钒溶液的配制方法铬钒溶液的配制方法 将将5g5g铬明矾铬明矾 K2SO4Cr2 SO4 24H2O K2SO4Cr2 SO4 24H2O 加加 入入90ml90ml蒸馏水中 溶解后加入蒸馏水中 溶解后加入0 1g0 1g焙花焙花 青 混匀并加热至沸腾 煮沸青 混匀并加热至沸腾 煮沸5 5分钟后冷分钟后冷 却至室温 过滤 加蒸馏水定容至却至室温 过滤 加蒸馏水定容至100ml100ml 染色操作染色操作 花药应该在花药应该在卡诺氏固定液中卡诺氏固定液中固定固定20min20min 然后取 然后取 出放在载玻片上 出放在载玻片上 加焙花青加
8、焙花青 铬钒溶液染色 铬钒溶液染色 盖上盖玻片后在显微镜下检查 盖上盖玻片后在显微镜下检查 这种方法能将 花粉细胞核染成蓝黑色 1 1 酒精处理 酒精处理 花蕾用体积分数花蕾用体积分数为为70 70 的酒精的酒精浸泡浸泡 3030秒 立即取出 秒 立即取出 无菌水清洗无菌水清洗 无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分 二 材料的消毒 2 2 消毒液处理 消毒液处理 放入放入质量分数为质量分数为0 1 0 1 的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中2 42 4 分钟 也可质量分数分钟 也可质量分数为为1 1 的次氯酸钙溶液或饱的次氯酸钙溶液或饱 和漂白粉溶液和漂白粉溶液 无菌水冲洗无菌水
9、冲洗3 53 5次次 用于培养花药 实际上多数未熟 由于它的外用于培养花药 实际上多数未熟 由于它的外 面有花萼 花瓣或颖片保护 面有花萼 花瓣或颖片保护 通常处于无菌状通常处于无菌状 态 所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可 态 所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可 二 材料的消毒 在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药 要彻底去除花丝 要彻底去除花丝 因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药 不利于愈伤组织或胚状体的形成不利于愈伤组织或胚状体的形成 立即将花药接种于培养基上 通常每瓶立即将花药接种于培养基上 通常每瓶接种花接种花 药药7 107 10个个
10、1 1 剥取花药 剥取花药 勿损伤花药 以免诱导出非花粉愈伤组织勿损伤花药 以免诱导出非花粉愈伤组织 2 2 接种 接种 注意 注意 三 接种和培养 培养条件 温度控制在培养条件 温度控制在25 25 左右 不需要左右 不需要 光照 光照 幼小植株形成后才需要光照 幼小植株形成后才需要光照 3 3 培养 培养 培养 一般经过培养 一般经过20 3020 30天培养后 会发现花药天培养后 会发现花药 开裂 长出愈伤组织或释放出胚状体开裂 长出愈伤组织或释放出胚状体 长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养 基上 以便进一步分化出再生植株基上 以便进一步
11、分化出再生植株 注意 如果花药开裂释放出胚状体 则一个注意 如果花药开裂释放出胚状体 则一个 花药内就会产生大量幼小植株 花药内就会产生大量幼小植株 必须在花药开必须在花药开 裂后尽快将幼小植株分开 裂后尽快将幼小植株分开 分别移植到新的培分别移植到新的培 养基上 否则这些植株将很难分开 养基上 否则这些植株将很难分开 在花药培养中 特别是通过愈伤组织形成的花在花药培养中 特别是通过愈伤组织形成的花 粉植株 常常会出现染色体倍性的变化 主要粉植株 常常会出现染色体倍性的变化 主要 原因是原因是营养核和生殖核融合营养核和生殖核融合造成的 造成的 4 4 鉴定和筛选 鉴定和筛选 5 5 植物组织培
12、养技术与花药培养技术的异同点 植物组织培养技术与花药培养技术的异同点 项目项目相同点相同点不同点不同点 植物组织植物组织 培养技术培养技术 离体的植物组织离体的植物组织 经脱分化形成愈经脱分化形成愈 伤组织 再分化伤组织 再分化 成丛芽 诱导出成丛芽 诱导出 根 然后进行移根 然后进行移 栽 栽 外植体为体细胞 染色体数外植体为体细胞 染色体数 无需加倍 无需加倍 花药培养花药培养 技术技术 取材为花药 培养的为单倍取材为花药 培养的为单倍 体幼苗 植株弱小 高度不体幼苗 植株弱小 高度不 育 必须用秋水仙素处理 育 必须用秋水仙素处理 使染色体加倍 恢复正常植使染色体加倍 恢复正常植 株的染
13、色体数 而且为纯种株的染色体数 而且为纯种 选材是否恰当选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的选材是否成功是花药培养成功的 关键 应学会通过显微镜观察处于适关键 应学会通过显微镜观察处于适 宜发育期的花粉 宜发育期的花粉 课题成果评价 课题成果评价 课题成果评价 课题成果评价 无菌技术是否过关无菌技术是否过关 如果出现了污染现象 说明某些如果出现了污染现象 说明某些 操作步骤 如培养基灭菌 花蕾消毒操作步骤 如培养基灭菌 花蕾消毒 或接种等有问题 或接种等有问题 课题成果评价 接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织 或释放出胚状体 花药培养的第一 步就成功了 要适时转换培养基 以便愈伤组
14、织或胚状体进一步分化 成再生植株 课题成果评价 课后练习1 F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或AAsusu 如果运用常规育种方法 将F2代中的紫色甜玉米与白色 甜玉米 aasusu 进行测交 可以选择出基因型为AAsusu 纯种紫色甜玉米 但这种方法比较繁琐 耗时也较长 需 要至少三年的选种和育种时间 如果利用花药培养的技术 在F1代产生的花粉中就可能有Asu的组合 再将花粉植 株进行染色体加倍 就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体 AAsusu 这种方法可以大大缩短育种周期 激素 激素种类和浓度对花药培养的影响 花药壁分化程度高 重新分裂需要较高 的激素浓度才能启动 因此 花药培养基 的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细 胞的分裂 确定适宜的激素浓度 以促使花粉细胞 分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是 成功获得单倍体的关键 知识拓展 诱导培养 多数植物用2 4 D 和KT 但浓度不同 有些植物用BA和NAA 2 4 D 和KT浓度对诱导单倍体的频率 有较大影响 高浓度2 4 D主要诱导花药 形成愈伤组织 不能形成胚状体 所以 2 4 D激素水平要相对较低 知识拓展
