无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增 CIK细胞分泌细胞因子水平的比较

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1、1无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增 CIK 细胞分泌细胞因子水平的比较【摘要 】 目的 比较无血清培养基（AIMV）与完全培养基（CM）体外诱导扩增 CIK 细胞及 CIK 细胞分泌细胞因子水平。方法 分别用 AIMV 及完全培养基加入 4 种细胞因子(IFN、IL2 、IL1 及 OKT3)将脐带血单个核细胞(CBMNCs)诱导成 CIK 细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。结果 与完全培养基比较，无血清培养基培养的 CIK 细胞增殖高峰较晚(1417 天),但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培养基培养的 CIK 细胞均无明显的差别（P0.05） 。结论

2、 无血清培养基可代替完全培养基。 【关键词】 无血清培养基 免疫 细胞培养 细胞因子 肿瘤0 引言CIK 细胞（Cytokineinduced killer， CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如 IFN、IL2 、IL1 及 OKT3等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。Critzapis 等1报道，CIK 细胞分泌多种2细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。治疗所需的 CIK 细胞在体外培养时所用的条件对细胞的活性有很大影响。现在常用于细胞培养的完全培养基,因含有人 AB 血清,虽经HBV、HCV 及 H

3、IV 的检测 ,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;并且存在批次差异、不宜质控，质量不能保证。无血清培养基则可达到生物洁净要求,成分明确, 质量稳定,便于质控, 克服了人血清的缺点, 能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。为此,我们比较了无血清培养基（）与完全培养基(含10%胎牛血清 RPMI 1640)培养 CIK 细胞分泌细胞因子水平。1 材料与方法1.1 材料健康足月产胎儿脐带静脉血 50ml(枸橼酸钠抗凝),产妇各项生化指标检测正常。RPMI1640 培养基、淋巴细胞分离液和无血清培养基购自 GIBCO 公司,细胞因子购自 Bioscience 公司, 流式试剂CD

4、45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITC CD16+CD56PE和 PI 染液购自 BeckmanColuter公司，胎牛血清购自美国 Hyclone 公司。1.2 方法31.2.1 细胞培养脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度 2500r/min 离心 30min 分离的外周血单个核细胞, 分别用完全培养基(RPMI 1640,含 10%胎牛血清,100/链霉素,100/青霉素)和无血清培养基调整细胞数为 1106 个/ml,接种于 24 孔培养板,930l/ 孔。第 1 天加入rhIFN 1 000u/ml,培养 24h 后加入 rhIL2 300u/ml、rhIL1

5、 100u/ml 及 OKT 350ng/ml 继续培养,每隔 4d 更换培养基,调细胞数为 1106 个/ml,补加 rhIL2 300u/ml,每 8d 在补加 rhIL2的同时补加 OKT 350ng/ml。YTMLC 、GLC 和 A549 用含 10%的胎牛血清、100u/ml 青霉素、100g/ml 链霉素的 RPMI 1640 常规培养。设不加细胞因子的 CBMNCs 培养作为对照。1.2.2 细胞表型分析于培养的第 0、4、8、10、12、14、17、21d 对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测 4 个复孔。1.2.3 细胞增殖能力测定于培养的第 0、4、8、10、12、14

6、、17、21d 分别取细胞用台4盼蓝拒染法计数所培养的活细胞浓度,根据流式检测的 CIK 的比例，计量液量,推算 CIK 细胞总数。1.2.4 CIK 细胞分泌 IL2、IFN 、TNF 细胞因子水平测定于培养的第 0、4、8、10、12、14、17、21d 分别取细胞,充分洗涤, 调整细胞浓度为 2106/ml 培养 24后, 收集上清,用法定量测定细胞培养上清中 IL2、IFN 、TNF ，设4 个平行孔。2 结果2.1 与完全培养基培养 CIK 细胞增殖能力的比较实验表明, 培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓。完全培养基增殖高峰期在第 12d，增殖平台为第 1012d，最高增殖倍数为

7、638.4 倍；而培养基增殖高峰期在第 14d，增殖平台为第 1417d，最高增殖倍数为 678.7 倍。虽然培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培养基高，见图 1。图 1 AIMV 与完全培养基培养 CIK 细胞增殖能力52.2 与完全培养基培养细胞表型比较实验结果表明，两种培养基培养的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在培养基中，增长高峰在 1417d，所占相对百分率由（0.210.04）上升为（31.531.65）,增长了150.14 倍，完全培养基增长高峰在 1214d，所占相对百分率由（0.21

8、0.04）上升为（30.902.28） ，增长了 147.14 倍。对照组CBMNCs 培养体系中未出现明显的细胞表型转化,各种细胞成分均呈递减趋势，见表 1、图 2。2.3 AIMV 与完全培养基培养的 CIK 细胞分泌细胞因子水平2.3.1 IL2水平AIMV 与完全培养基培养的 CIK 细胞均分泌 IL12，从第 4d 分泌量均稳定升高，都于 12d 达到高峰，第 14d 略有下降为，以后逐渐下降。但 AIMV 培养基第 12d 的 IL2水平（222.52519.889） pg/ml 明显高于完全培养基培养组（189.0756.343）pg/ml，且下降水平也慢于 CM 组，见图 3。

9、6A：培养前；B：完全培养基培养后；C：AIMV 培养基后表 1 与完全培养基培养细胞不同时间的表型变化2.3.2 IFN水平AIMV 与完全培养基培养的 CIK 细胞均分泌 IFN，在第 4d IFN水平开始升高，第 1417d 分泌量增大，完全培养基培养组第 17d 达到高峰为（246.8544.758） pg/ml，而 AIMV 组 14d达到高峰（227.883.048）pg/ml ，高峰期后均迅速下降，见图4。2.3.3 TNF水平AIMV 与完全培养基诱导培养的 CIK 细胞均分泌 TNF，第417dTNF 水平均平稳升高，完全培养基组第 17d 达到高峰为（247.0329.11

10、7） pg/ml，第 21d 略有下降为（186.9533.815）pg/ml，而 AIMV 组 14d 达到高峰为（222.538.965）pg/ml，之后 TNF水平开始下降，见图 5。3 讨论CIK 生物免疫治疗已作为肿瘤综合治疗中的一种重要手段，能清除恶性肿瘤患者术后、放化疗后微小残留病灶及调节患者的免疫能7力。但现在用于 CIK 扩增培养的培养基一般为 AB 血清培养基，但人血清存在安全性低,不宜质控等缺点,无血清培养基正得到越来越广泛的应用。多数研究表明,无血清培养基可代替含血清的完全培养基, 二者所得培养物的数目和功能相当24; 但也有不同的观点,认为应用无血清培养基所得细胞功能

11、受到损害5,6。无血清培养基是美国公司专为体外培养淋巴细胞设计的产品,可用于临床试验。因为人血清存在个体差异、质量不稳定等诸多的不确定因素,因而我们选择美国公司的胎牛血清配制完全培养基作为标准对照,与无血清培养基作对比，探讨无血清培养基代替完全培养基的可行性。我们从细胞增殖能力、细胞表型分析及体外 CIK 细胞分泌的细胞因子等几个方面进行比较。在细胞增殖能力方面，虽然培养基培养的 CIK 细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，完全培养基增殖高峰期在第 12 天，增殖平台为第 1012 天，而培养基增殖高峰期在第 14 天，增殖平台为第 1417 天，但培养基培养的 CIK 细胞增殖平台期较长，增殖

12、倍数（678.7 倍）较完全培养基（638.4 倍）高。这说明无血清培养基支持细胞增殖能力的更为稳定可靠，也提示使用不同的培养基在回输时间上应有所区别。在两种培养基培养单个核细胞诱导增殖的过程中，各细胞表型虽在培养过程中有一定的差异，但在增殖高峰期无明显差别。8CIK 细胞具有较强的杀瘤活性，其作用可能与其在增殖过程中能分泌某些细胞因子有关，其主要效应细胞为 CD3+CD56+细胞，并出现大量增殖，Lopez 等7发现 CD56+细胞能高表达 IFN和TNF，Hoyle 等8用 FACS 检测到 CIK 细胞能表达IL2、IFN 及 TNF，这与我们的研究结果:CIK 在体外诱导培养过程中能分

13、泌 IL2、IFN 、TNF 一致。细胞因子在抗肿瘤的网络调控机制非常复杂，IL2 、IFN 、TNF 在体内外抗肿瘤的过程起着重要的抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。分泌 IL2，从第 4 天分泌量均稳定升高，都于 12 天达到高峰，以后逐渐下降。但 AIMV 培养基第 12 天的 IL2水平（222.52519.889）pg/ml明显高于完全培养基组（189.0756.343）pg/ml ，下降水平也慢于 CM 组；IFN 水平在第 4 天均开始升高，第 14 17 天分泌量增大，完全培养基组第 17 天达到高峰为（ 246.8544.758） pg/ml，而 AIMV 组 14 天达到高峰

14、（227.883.048）pg/ml；而TNF，第 417 天 TNF水平均平稳升高，完全培养基组第17 天达到高峰为（247.0329.117） pg/ml，而 AIMV 组 14 天达到高峰为（222.538.965）pg/ml 。可见，无论是 AIMV 培养基还是完全培养基其分泌细胞因子的趋势是一致的，只是分泌IFN、TNF 水平 AIMV 培养基（14 天）较全培养基（17 天）早，但分泌水平无明显差别（P0.05） 。AIMV 培养基分泌细胞因子高峰与 CIK 效应细胞 CD3+CD56+细胞增殖高峰一致（14 天） ，因 CIK 细胞回输时间最好应为在 CIK 细胞增殖高峰及细胞因

15、子分泌9高峰时，这有利于发挥其最佳疗效，从这方面考虑，AIMV 培养基优于全培养基。我们的实验表明，无血清培养基成分明确,来源稳定,功能可靠,易于质控，有利于保障患者治疗的安全。可完全替代完全培养基，避免不必要的医疗纠纷，因而在生物治疗中有巨大的优势和广阔的应用前景。【参考文献】 1 Critzapis A D, Dimitroulopoulos D, Paraskevas E, et al. Large scale expansion of CD3+CD56+ lymphocytes capable of lying autologous tumor cells with cytokinerich supernatantsJ. Cancer Immunol Immunother,2002,51(8):440448.2Lefebvre P, Winter J N, Kahn L E, et al. Megakaryocyte ex vivo expansion potential of three hematopoietic sources in serum and serumfree medium J. J Hematother,1999,8（2）