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1、沉降菌测试方法1、把90mm15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180后，干烤2小时。2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在28环境中保存。4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m
2、1.5m左右。5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用510倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对
3、非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。8、平均菌落数计算：M1+M2+M3平均菌落数= n培养皿总数M11号培养皿菌落数M22号培养皿菌落数Mnn号培养皿菌落数用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级1个；10000级3个；100000级10个）。若某洁净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。人员进出洁净生产区的一般程序：换鞋脱外套穿工洁作净服气或吹闸空淋室气室洁净生产区手消毒洗手进单旁门向通 出人员进出无菌操作洁净生产区程序：洗脸手腕手消毒手消毒
4、穿无菌外衣换无菌鞋无洁菌净操生作产 区气气闸吹室淋或室空穿无菌内衣脱内衣脱外套换鞋进出无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：监测项目 技术指标 监测方法 监测频次100级 10000级 100000级 300000级温度（） 1828 1次/班相对湿度% 4565 1次/班 水平层流风速m/s 0.4 JC 垂直层流 1次/月 0.3换气次数 20 15 12 1次/月静压差Pa 不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间5 洁净室与室外大气10 1次/月沉降菌数 1 3 10 15 GB/T16294-1996 1次/周附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求洁净室（区）沉降菌技术要求洁净度级别
5、澳大利亚TGACGMP(2002年8月16日)欧盟EUCGMP附录l(2008年2月)美国FDACGMP（2004年9月）药品生产质量管理规范（1998修订）90mmCFU/4ha90mmCFU/4ha90mmCFU/4ha沉降菌/皿，0.5h100A级1A级111-B级5B级53（1000级）-10000C级50C级5053100000D级100D级1005010为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。无菌检查法试验步骤无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。1、器具灭菌：培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱
6、内180，2小时。2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。硫乙醇酸盐流体培养基置33培养48小时，应无菌生长。改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。改良马丁培养基置24培养72小时，应无菌生长。营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#
7、培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物。取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置33培养，改良马丁置24培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。5、结果判断：
8、在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。细菌内毒素试验步骤：1、准备工作：移液管：0.1ml1支，1ml10支试管：10ml4支，试管架2个（大小）烧杯40ml2个，锥形瓶2个试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内180干烤至少2小时。细菌内毒素检查水10ml4支细菌内毒素工作标准品1支，每安瓿含内毒素10EU鲎试剂 0.1ml8支同一批号3支瓣膜浸提介质：细菌内毒素检查水浸提介质体积计算公式：V=8.6（ml）8.63=25.8（ml）把细菌内毒素检查水
9、4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37恒温培养箱中，培养1.5小时。供试液贮存应不超过2小时。注：V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）-所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）2、细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟。用移液管取0.1ml工作标准品和0.9ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。用移液管从第1管中取0.5ml混合液和0.5ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。（阳性对照溶液）用移液管取
10、0.1ml工作标准品和0.9ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。用移液管从第3管中取0.5ml混合液和0.5ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。（供试品阳性对照溶液）3、把8支鲎试剂外表擦净全部打开放进试管架中，每支各加入0.1ml细菌内毒素检查水，在旋涡器上混匀，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。每支供试品管加入0.1ml供试液；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阴性对照管加入0.1ml阳性对照溶液；供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入371恒温器中孵育602分钟，然后取出观察结果，试管在孵育期间应避
11、免任何振动。4、结果判断：将试管从水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（），未形成凝胶或形成凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（）。阴性对照管均为阴性，阳性对照管，供试品阳性对照管均为阳性，试验有效，否则无效。若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查水或实验器具受污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂灵敏度及标准内毒素效价标示不准确或标准内毒素稀释有误。供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应干扰因素存在。一、氯化物1、配制标准溶液：0.1mol/L硝酸银溶液。 称取1.6987g分析纯硝酸银，定溶至100ml容量
12、瓶中，转入棕色试剂瓶中，避光保存，贴标签。2、取样，量取50ml样品水平行样（2份）倒入试管中，加5滴硝酸，再加入1ml硝酸银。均不得发生浑浊。二、硫酸盐1、配制标准溶液：称取50.5g氯化钡（分析纯），定溶至100ml容量瓶，倒入试剂瓶，贴标签。（如果浑浊，把蒸馏水烧开，放凉再用）2、分析：取样50ml平行样（2份）倒入试管中，加2ml氯化钡溶液，不得发生浑浊。三、钙盐1、配制标准溶液： 称取分析纯草酸铵3.5g，定溶至100ml容量瓶，贴标签。2、分析：取样50ml平等样2份，倒入试管中，加2ml草酸铵溶液，均不得发生浑浊。四、二氧化碳1、配制标准溶液： 称取分析纯氢氧化钙0.3g，定溶至
13、100ml容量瓶，用橡皮塞塞紧，用力振摇，放置1小时，用时取清液。2、分析：取样25ml平等样（2份）倒入带盖的试管中，加25ml氢氧化钙溶液，放置1小时，振摇，1小时内不得发生浑浊。五、易氧化物1、配制标准溶液：高锰酸钾溶液：取3.3克高锰酸钾，加水1050ml，煮沸15分钟，加水到1000ml，密塞后静置2天以上，用微孔玻璃漏斗过滤，摇匀，标定其浓度。稀硫酸：取分析纯硫酸（98%）57ml，（注意烧杯里放蒸馏水，沿杯壁缓慢倒入硫酸57ml，定溶至1000ml，放凉再用）2、标定：取在105干燥至恒重的基准草酸钠约0.2克，精密称定，加新沸过冷水250ml与硫酸10ml搅拌使溶解，自滴定管中迅速加入本液约25ml，待褪色后，加热到65，继续滴定至溶液显微红色并保持
