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1、沉淀反应 基本概念 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应生成沉 淀物 特点 反应物可溶 溶液 生成物为沉淀 抗原抗体均为多价 相互结合 形成空 间网格 体积变大而从溶液中析出 抗原抗体的比例对试验现象的影响明显 类型 反应场所 检测方法 液相沉淀试验 凝胶扩散试验 凝胶免疫电泳试验 液相内沉淀试验 环状沉淀试验 原理 将抗原液叠加在已知的抗体溶液上面 在两液的 交界面抗原抗体发生反应生成白色沉淀环 抗体 抗原 沉淀环 方法评价 简便快速 但只能定性且 灵敏度低 少用 絮状沉淀试验 原理 抗原溶液与抗体溶液混合 在电解质存在的条件 下 两者结合出现肉眼可见的絮状沉淀 方法评价 方法简单
2、 不需特殊设备 灵敏度低 受抗 原抗体比例影响明显 少用 可用于确定对应抗原抗体 反应的最适比 免疫浊度测定 一定比例的抗原抗体反应可生成肉眼不可见的 一定大 小的复合物 光束通过该溶液时 免疫复合物对光会产生作用 吸收 折射 作用的大小与复合物的多少呈正相关 根据测量手段和方法的不同可分为 透射比浊法 终点 散射比浊法和速率散射比浊法 透射比浊法 原理 在固定且过量的抗体中加入待测的抗原 经过一段时间 反应后生成复合物 复合物的量与待测抗原含量成正比 当光束通过该溶液时 被复合物吸收 反射 导致透射 光的减少 减少的程度与复合物的量成正比 以已知抗原的浓度为横坐标 对应的吸光度为纵坐标 建立
3、标准曲线 通过测定待测抗原反应后溶液的吸光度 大小 在曲线上测出待测抗原的浓度 方法评价 灵敏度较高 重复性较好 操作简便 对仪器要求不高 反应时间长 参加反应的抗原抗体比例要保证抗体过剩 且不能极度过剩 终点散射比浊法 原理 为改良的透射比浊法 测定散射光强度 方法评价 方法灵敏 可自动化 反应时间适当 影响因素较多 需特殊仪器 速率散射比浊法 原理 在过量的抗体中加入待测的抗原 两者反应生成免疫复合 物 在反应达终点之前 复合物数量递增 在不同的时间点上 复合物增加的量 速率 是不同的 而最大速率 峰值 只有一个时间点 在反应的过程中 峰值出现的时间点很快出现并能被特殊 的仪器捕捉 测出
4、峰值的大小与待测抗原的含量成正比 方法评价 测量快速 灵敏 精密度高 稳定性好 需特殊仪器 凝胶的制备 原料 固体粉末 琼脂 琼脂糖 葡聚糖 聚丙烯酰胺 电解质液 过程 按要求把一定比例 1 的固体粉末与电解质液混 合 加热助溶 冷却 形成具有三维空间网孔的半固体结构 性质 实为流动的液相 网孔的大小与凝胶的浓度成反比 小分子的颗粒在凝胶中自由运动 动力来源于物质的浓 度差 而大分子物质的运动则受到网孔的限制 单向琼脂扩散试验 原理 待测抗原在含在一定量的抗体中自由扩散 在抗原抗体比例合适处形成大分子的抗原抗体复合物而 被限制在网孔中 形成肉眼可见的沉淀环 待测抗原与沉淀环的直径成正比 方法评
5、价 定量检测物质 方法稳定 简便 无需特殊仪器 灵敏度稍差 双向琼脂扩散试验 原理 抗原抗体在凝胶中自由扩散 发生相遇 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 类型 成对孔 三角形孔 梅花形孔 成对孔 应用 定性 沉淀线的有无 相对浓度 沉淀线的位置 靠近浓度小的一侧 相对扩散率 沉淀线的形状 弯向扩散慢的一侧 三角形孔 沉淀线吻合 两种 抗原完全相同 沉淀线相交 两种 抗原完全不同 沉淀线相切 两种抗 原之间部分相同 梅花形孔 中间孔为Ag 周边孔为倍比稀释Ab 出现沉淀线孔的Ab最高稀释度为待测抗体的效价 免疫电泳技术 带电颗粒在电场中的运动 抗原抗体在凝胶中为带电颗粒 在电场的作用下向相反电极
6、运动为电泳 某些凝胶 琼脂 固体骨架上基团为阴离子 感应其附 近的水分子带上正电荷 这种水分子在电场的作用下运 动方向为正极到负极 同时推动颗粒的运动为电渗 颗粒的运动为电泳和电渗的合运动 类型 免疫电泳 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 免疫电泳 原理 电泳 分离复杂组分 不同的蛋白质的PI 分子量不同 在电场中的运动速度不同 相同时间在凝胶中的停留位置不同 双扩 在与电泳平行方向挖槽 加混和抗体 与分离开的组分自 由扩散 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 应用 用于复杂抗原的成分分析 火箭免疫电泳 原理 在电场的作用下 抗原 在含一定量抗体的凝胶 中扩散 形成肉眼可见的沉淀峰 待测抗原的浓度与沉 淀峰的高度成正比 方法评价 操作简单 重复性好 灵敏度高 电场中的单扩 对流免疫电泳 原理 在电场的作用下 抗原抗体相向运动 在比例合适处 形成肉眼可见的沉淀线 AgAb 方法评价 电场中 的双扩 将双扩的自由扩散变为定向运动 使反应快速 灵敏度提高
