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1、中枢神经系统疾病的基因治疗 石奕武 神经科学研究所 广州医学院第二附属医院 1 概 述 2 定义 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组 以校正和置换致病基因的一种治疗方法 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内 使其在体内发挥作用 以 达到治疗疾病目的的方法 基因治疗的概念 3 基本程序 治疗性基因的选择基因载体的选择 回输体内 重组表达载体靶细胞的选择 基因转移 筛选能有效 适度表 达目的基因的靶细胞 重组表达载体导入靶细胞 4 应用与展望 1 单基因缺陷病 2 体细胞的基因治疗 3 靶细胞可以从病人机体获取 4 治疗效果胜过危害 5 表达水平无需严格调控 6 动物实验证明符合严
2、格的安全标准 5 研究概况 1990年 美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案 即将腺苷脱氨酶 ADA 导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征 SCID 的女孩 采用的是反转录病毒介导的间接法 即用含有正常人 腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞 并用白细胞介素 IL 2 刺激其增殖 经10天左右再经静脉输入患儿 大约1 2月 治疗一次 8个月后 患儿体内ADA水平达到正常值的25 未见明显 副 作用 此后又进行第2例治疗获得类似的效果 致使世界各国都掀起了 基因治疗的研究热潮 6 经过十几年的发展 基因治疗已取得初步的临床疗效 例如2000年 法国巴黎内克尔儿童医院利
3、用基因治疗使11名有免疫缺陷的婴儿恢 复了正常的免疫功能 尽管后来有一名儿童患了白血病 但这仍是近 十年来基因治疗取得的最大成功 目前每年用于基因治疗上的总投资 在10亿美元左右 主要集中在美国 其次是欧洲 到2001年底全世界 已批准了600个基因治疗临床试验方案 其中针对癌症治疗的方案居首 位 有378个方案 占总数的63 1 其次是针对单基因疾病 心血管 病 传染性疾病 主要是HIV 基因标记和其他疾病治疗方案 7 神经系统疾病的防治 人们面临的巨大挑战 大多数炎症 营养缺乏性疾病及良性肿瘤等 通过传统的药物 手术和饮食疗法可以治愈 相当多的疾患不能治愈 帕金森病 亨廷顿病 等 有一些疾
4、病至今仍无防治方法 如阿尔茨海默 病及恶性肿瘤等 全新的治疗概念 中枢神经系统 CNS 的基因 治疗 gene therapy 8 一 中枢神经系统基因治疗概述 存在着一定的困难 CNS被严密的骨质系统所包裹 使得一些重要 的 物理操作相对难以进行 完整的血脑屏障 BBB 的存在是向脑内导入基 因转移载体的天然屏障 9 神经系统功能的分子机制及其疾病的分子遗传学变 化最近才缓慢地得到了初步的认识 因此 能够通过基 因修饰而得到治疗的神经系统疾病较少 对于某些CNS代谢性疾病 如溶酶体蓄积病 在出生 之前就已经在细胞内有大量毒性物质的堆积 提示必 需在胚胎期就进行治疗才有可能取得满意的疗效 10
5、 神经系统由多种功能不同并且高度分化的细胞组 成 细胞之间存在着不同的 复杂的甚至是变化着的 联系 不同的神经元和胶质细胞之间在结构上和功能 上可能存在着相当大的差异 因此 神经系统远比其 它器官都要复杂 11 神经细胞或胶质细胞均很难大量分离以用于原 代培养和遗传修饰 对成熟神经元和 或胶质细 胞进行遗传修饰并有效地进行脑内移植的技术方 法还未完全成熟 12 随着近年来基因治疗的技术方法上的进展 初步 结果显示基因治疗在CNS疾病的治疗中也具有广 阔的应用前景 其原因在于 随着定位克隆和疾病相关基因的分离和鉴定技 术的发展 越来越多的神经系统疾病的遗传学病 因得到了澄清 13 随着对疾病发生
6、发展的分子机制了解的 深入 目前已经确认的基因治疗方法不仅适 用于有明确基因改变的遗传性疾病 而且也 适用于非遗传性疾病的治疗 14 可以使用非神经细胞或非胶质细胞 如自 体成纤维细胞或成肌细胞 作为遗传修饰细 胞 最近发现有些药物可造成BBB的一过 性渗透性损伤 从而使大分子物质甚至基因 转移载体进入脑内 15 已成功地构建了一些新型的 能够感染非 分裂期终分化细胞 如神经元 的病毒基因转 移载体 如复制缺陷型重组腺病毒 疱疹病毒 及腺病毒相关病毒等 从而使向成熟神经元 和 或胶质细胞内直接进行基因转移成为可 能 16 一 中枢神经系统基因治疗的分类 根据靶细胞分类 生殖细胞 germ ce
7、ll 基因治疗 将受精卵或早期 胚胎细胞做为治疗目标进行生殖细胞的基因治疗 是可行的 受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势 必影响后代 伦理学障碍和技术上的困难使生殖 细胞基因治疗目前仍为禁区 17 体细胞 somatic cell 基因治疗 体细胞基因治疗 只涉及体细胞的遗传转变 不影响下一代 现已被 广泛接受做为CNS严重疾病的治疗方法之一 在现 代 伦理道德上是可行的 方法上易于施行 而且已取 得了可喜的成果 18 根据基因转移的途径 in vivo 活体直接转移 或称一步法 指将含外源基因的重组病毒 脂质体或裸露的DNA直 接导入CNS内 操作简便 容易推广 尚不成熟 存在疗效短 免疫排斥
8、及安全性等问题 基因转移研究的方向 只有in vivo基因转移方法成 熟了 基因治疗才能真正走向临床 19 指外源基因克隆至一个合适的载体 首先导入体外 培养的自体或异体 有特定条件 的细胞 经筛选后 将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者CNS 内 实质上就是遗传修饰细胞的脑移植 经典 安全 而且效果较易控制 但是步骤多 技 术复杂 难度大 不容易推广 ex vivo 离体转移或称二步法 20 二 中枢神经系统基因治疗的策略 根据宿主CNS病变的不同 CNS基因治疗的策略也不同 概 括 起来主要有下列四种 1 基因替代 gene replacement 指去除整个变异基因 用有功能的正常基
9、因取而代之 使致病基因得到永久的更 正 优点 遗传性疾病等的最理想的方法 缺点 难以实现 21 2 基因修正 gene correction 将致病基因的突变 碱基序列纠正 而正常部分予以保留 如基因打靶技术 同源基因重组 的研究进展已表明 哺乳动物细胞基因组确实存在着某些结构和酶学机 制 可使外源DNA在特定的部位进行重组 从而使缺 陷基因在原位特异性修复成为可能 22 3 基因增强 gene augmentation 将目的基因导 入病变细胞或其它细胞 目的基因的表达产物可以补 偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强 近十年来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导 入真核细胞 并获得表达
10、因而是目前较为成熟的方 法 最适宜隐性单基因疾病的治疗 23 4 基因抑制 gene constraint 和 或基因失 活 gene inactivation 导入外源基因去干 扰 抑制有害的基因表达 如向肿瘤细胞导入 肿瘤抑制基因 如Rb或p53 以抑制癌基因的 表达 24 此外利用反义技术 antisense technology 封 闭某些特定基因的表达 以达到抑制有害基因 表达的目的 已被广泛用于CNS恶性肿瘤 如胶 质母细胞瘤 等的基因治疗研究中 25 三 中枢神经系统基因治疗的原则 必须分离出含有调节序列的特异性基因 必须能够获得足够数量携带该基因的载体或 和细胞 26 必须建立
11、一条有效的途径将该外源基因导入脑 内 转染靶细胞 最后转染入宿主脑细胞的目 的基因必须能产生足够量的产物 可维持适当 长的时间 且不产生有害的副作用 导入CNS内的基因要特异 稳定 高效 安全 并 具有可调控性 27 n1 目的基因的选择 该基因的异常是疾病发生的根源 该基因遗传的分子机制清楚 基因已被克隆 一级结构和表达调控机 制较为清楚 28 可在体外操作 而且安全有效 转移基因在受体细胞内最好能够完整地 稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白 质 29 染色体基因组 互补DNA complementary DNA cDNA 多数是通过cDNA的克隆化技术得到的 可 应 用人工合成 PCR技
12、术扩增等途径获得目的 基 因 2 目的基因来源 30 目的基因必须置于合适的启动子的控制之下 编码基因的信号肽序列 signal sequence 必须 完整 只有这样 目的基因才可获得适当的表 达 基因调控是目前基因治疗研究的薄弱环 节 31 其原则为 最好选择组织特异性细胞 即外源基因仅 在该系统组织中表达 而在其它组织中不表达或表达水 平较低 细胞要易于从体内取出 有增殖趋势 且生 命周期较长 使得有足够的时间进行体外基因操作 n3 受体细胞的选择 n 成败的一个关键因素 选择病变发生细胞 非病 变发生细胞 32 离体的细胞要能接受外源基因的转染 细胞经过体外基因操作后能够存活下来 并能
13、安 全输送回体内 能预设某一安全机制 在必要时可激活以阻止修 饰细胞在体内有害的生长和 或有害功能的发挥 以避免肿瘤发生 33 目前 应用于CNS基因治疗研究的靶细胞主要有 成纤维细胞 原代骨骼肌细胞 胶质细胞 胚胎 中脑细胞 条件永生性神经细胞及神经干细胞 适合于基因转染及脑内移植的靶细胞最好来自宿 主自身的同源细胞 以避免发生免疫排斥 34 胶质细胞 优势是能很好地在体外生长与繁殖 移植到脑内 靶点后可很好地存活并整合到脑实质中 可获得 长期 稳定的转基因表达 是一种潜在的基因治 疗细胞载体 其缺陷是植入脑内成瘤的危害性大 35 胚胎中脑细胞 相对安全 但细胞难于获得 在体外培养较 难 且
14、不易用经典方法行基因转染 神经干细胞 最理想的转基因靶细胞 因它们在生长因子 作用下能够不断生长繁殖 且植入脑后也能 根据所处环境分化成相应细胞 并与宿主形 成突触联系 36 4 基因载体的选择 目的基因本身一般不含有启动子等调控序列 导 入靶细胞后很难得到目的基因的表达 因此 必 须将目的基因重组于表达载体的合适位置 再导 入细胞 在特定调控序列指导下进行表达 表达 载体有质粒载体 plasmid vector 和病毒载体 viral vector 两大类 37 n质粒载体 一般可用物理的 化学的以及融合法导入靶细胞 包含哺乳动物细胞的表达调控元件 细菌胞浆内进 行复制的表达元件 因此被称为
15、穿梭载体 shuttle vector 意指在哺乳动物细胞和原核生物细胞中 均能稳定复制 稳定存在的基因载体 38 目前被广泛应用于哺乳动物细胞的质粒载体 有pSV2 pRSV pcDNA3和pCI载体系列等 可插入较大长度的外源基因 10kb以上 有较广泛的宿主细胞范围 经转染的细胞不 发生裂解 故可建立稳定分泌外源蛋白的细 胞株 用于ex vivo基因转移 39 病毒载体的构建原则与质粒载体相似 但进入靶细 胞的方式不同 目的基因与病毒载体重组形成重组 载体 在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式 进行包装 获得重组的病毒颗粒 再感染靶细胞 以便将目的基因带入靶细胞 并得到目的基因的表 达
16、 有多种病毒载体 其特点各异 病毒载体 40 四 中枢神经系统基因转移的方法和实 施途径 CNS基因转移方法分为物理 化学和生物学三大 类 前两类是非病毒的方法 后一类即生物学方 法主要指病毒介导的基因转移 包括 病 毒 病毒两类 41 1 病毒载体介导途径 即以复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内 许多病 毒载体 包括逆转录病毒 腺病毒 单纯疱疹病毒 腺相关病毒 慢病毒及多种杂交型病毒载体等 已应 用于CNS基因治疗的基础和临床研究 作为基因治疗 的载体 要得到广泛应用 必须简单 安全 可靠 且能在宿主体内长期稳定表达 42 迄今为止 病毒载体用于CNS细胞基因传 递 取得了许多进展 尽管其安全性及效率仍 有待提高 但in vivo方法已成为目前CNS 基因转移的主要研究方向 只有in vivo方 法取得成功 CNS基因治疗才能走向临床 43 重组病毒载体因其自然感染途径而成为较有效的 基因转移手段 病毒载体用于脑内基因传递应具 备哪些特点呢 1 插入基因的容量必须足够 因载体内包含了目的基因 特异性调控序列及可 诱导的启动子 44 病毒载体的特点 2 脑内基因注射存在容量限制问题 故
