1成年与老年大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元形态学研究【摘要】 目的 研究大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元随年龄老化的形态学变化规律 ，探讨其退行性变的形态学依据方法 SD 大鼠 16 只，雄性，分为成年组(4 5 月龄) 和老年组 (≥18 月龄)取中脑黑质，常规制片，连续冠状切片，分别进行焦油紫染色和 TH 免疫组化染色，用图像分析仪分别对 Nissl 染色细胞、TH 免疫组化染色阳性神经元进行计数，透射电镜观察神经元的超微结构变化结果 老年大鼠中脑黑质神经元数量减少(P<0.05) ， TH 阳性神经元也同时减少(P<0.05)，且在超微结构上老年大鼠多巴胺能神经元出现内质网扩张及多量脂褐素形成结论 老年黑质退行性病变可能与中脑黑质致密部多巴胺能神经元数量减少有关 【关键词】 黑质致密部 多巴胺能神经元 Nissl 染色 免疫组织化学 大鼠 Abstract： Objective To study the rule of age-related morphological changes of dopaminergic neurons in substantia nigra compact of midbrain in rats to explore the morphological basis of the degenerative process. Methods SD rats for the present study were of two groups: 4-5 months and above 18 months (n=8 each). Routine paraffin sections were made for Nissl staining, TH immunohistochemical 2staining and electron microscopy. The neurons and the TH positive cells in the substantia nigra compact were counted by using morphometric technique; the ultrastructure of TH positive neurons was studied under electron microscope. Results The total number of neurons and the proportion of the TH positive neurons in the substantia nigra compact were both less in the aged rats than in the younger adult ones (P<0.05). Electron microscopy showed swelling of endoplasmic reticulum and accumulated pigment formation in the TH positive cells of aged rat. Conclusion There may exist a relation between age-related degenerative diseases and the numeral reduction of dopaminergic neurons in the substantial nigra compact of midbrain. Key words： substantia nigra compact; Nissl staining； immunohistochemistry; electron microscope; tyrosine hydroxylase; rat 随着人类平均寿命的增加，神经系统的老化日益受到重视。
中脑黑质神经元在多种老年性退行性病变中起着重要作用［1］ 多巴胺(dopamine，DA)能神经元是脑内分化最早、表达递质以及发出轴突到靶区的神经元之一，而中脑黑质致密部则是 DA 能神经元较为集中的区域之一［2-3］ 黑质致密部 DA 能神经元的特异性变性与帕金森病（PD ）有着非常密切的关系，其一直是神经科学研究3的热点目前，对老年与成年大鼠黑质致密部内 DA 能神经元的形态学变化研究得较少本研究采用 Nissl 染色、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH) 免疫组织化学染色及电镜等方法对老年和成年大鼠中脑黑质致密部 DA 能神经元的形态学变化进行研究，探讨 DA 能神经元在老化过程中的变化规律，以期为研究老年性退行性疾病的发病机制提供一定的形态学依据 1 材料和方法 1.1 实验动物及分组 健康 SD 雄性大白鼠 16 只，按月龄分为成年组(4 5 月龄，200 250 g)和老年组(≥18 月龄，500 600 g)，每组 8 只实验动物由徐州医学院实验动物中心提供 1.2 取材及制片 随机取每组中的 6 只大鼠，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉后开胸，从左心插管行 4%多聚甲醛灌注固定后取脑，后固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。
做黑质区段连续冠状切片，片厚 6 μm，切片分组收集，分别行 Nissl 染色、TH 免疫组织化学染色 每组中的另 2 只大鼠用含 4%多聚甲醛-0.125% 戊二醛的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PB，pH7.4)灌注固定，灌注毕立即取脑并将其切成冠状中脑厚片，把含有黑质的脑厚片置入 4%多聚甲醛-0.125 %戊二醛溶液中后固定 2 h用 0.1 mol/ L PB(pH7.4)充分漂洗，脑片机 200 μm 切片，保存于 PBS 中，以备透射电镜样本制作 1.3 Nissl 染色 Nissl 染色液由 0.1%的焦油紫 (Sigma 公司) 加少许冰醋酸制备而成用焦油紫染色确定黑质致密部平面，室温下染4色 10 min，95%乙醇快速分色(2 3 s 即可) ，脱水，透明，封片，镜检 1.4 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，用 3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，微波修复，0.5%正常羊血清封闭，37℃，30 min依次加入：小鼠抗 TH 抗体(Sigma 公司， 1∶3000)，生物素结合的羊抗小鼠 Ig(Sigma 公司，1∶50)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素-卵白素复合物(Sigma 公司) 。
以上各步骤之间均用 0. 01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗 3 次，每次 5 min最后用 DAB 进行显色反应梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片以 PBS代替一抗，作为空白对照 1.5 透射电镜样本制作 将保存于 PBS 中的中脑厚片再入 1.5%戊二醛溶液中固定 2 h，0.1 mol/ L PB(pH7.4) 充分漂洗，置 2%锇酸中后固定 1.5 h，梯度乙醇脱水，Epon 618 包埋、聚合将含黑质致密部的组织行半薄切片定位，超薄切片，日立 H-600 电镜观察并摄片 1.6 图像分析 用计算机辅助图像分析系统，参照 Paxinos 和Watson（1986 ）大鼠脑图谱，根据 Nissl 染色圈出黑质范围，将大鼠中脑组织从嘴侧至尾侧分为前、中、后 3 个亚单位每个亚单位取 4 张切片，任意选择带有明显核仁的有清晰细胞轮廓的神经元作为计数对象，测定整个右侧黑质致密部内神经细胞数，对 2 组的神经细胞进行定量分析 1.7 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计软件进行数据处理，应用单5因素方差分析方法进行显著性检验，P<0.05 为差异有统计学意义2 结 果 2.1 Nissl 染色 光镜下黑质神经元以大、中型细胞为主，常 3 5成群。
成年组大鼠黑质神经元胞体大，细胞排列密集，形状规则，细胞成椭圆形或锥体形，胞质丰富，每个细胞有清晰的胞核，核仁清楚可见，尼氏体粗大而深染（图 1） 而老年组大鼠神经元散在，数量少，胞质染色较淡，尼氏体较分散（图 2） 2 组大鼠黑质致密部神经元计数差异有统计学意义(P<0.05)，见表 1表 1 2 组大鼠黑质致密部 Nissl 染色和 TH 阳性细胞数比较 2.2 免疫组化染色 酪氨酸羟化酶是 DA 能神经元特异性标志酶，黑质内 TH 阳性神经元的变化代表了此处 DA 能神经元的变化TH免疫组织化学染色结果显示，TH 阳性神经元以大、中型多角形或锥形神经元为主，胞体较大，部分细胞可见类似轴突的突起，胞质内有均匀分布的棕褐色颗粒（TH 免疫反应阳性产物） ，TH 阳性细胞核不着色，呈圆形透亮区；TH 阳性细胞大多 3 5 个成群排列，致密部的腹侧区细胞较多，背侧区细胞较稀少（图 3） 老年大鼠 TH 阳性细胞胞质染色较淡，棕褐色颗粒分布稀少（图 4） 2 组阳性神经元统计结果显示：成年组与老年组比较，成年组大鼠 TH 阳性神经元数目明显增多（表 1） ，差异有统计学意义（ P<0.05） 。
2.3 电镜观察 为进一步提供这种变化的更可靠的形态学依据，我们又进行了超微结构的观察成年大鼠中脑黑质神经元细胞形态6正常，核大而圆，核仁清晰，胞质内可见高尔基体分布于核周，数量较多，粗面内质网散在分布，表面附着核糖体，线粒体结构清晰呈圆形、椭圆形，内嵴清晰可见，基质均匀；极少见内质网扩张和脂褐素形成，见不到凋亡的细胞，染色质分布均匀，核膜规则（图5） 老年大鼠中脑黑质神经元细胞形态基本正常，但胞质内可见明显内质网扩张和多量脂褐素形成，并常可见凋亡的神经元及胶质细胞的增生（图 6、7） 3 讨 论 正常黑质内有大量的 DA 能神经元，他们通过黑质-纹状体环路参与躯体运动的调控，脑内多巴胺能神经元 70%都位于中脑黑质的纤维主要投射到纹状体，此外还投射到端脑、丘脑及顶盖等区域黑质致密部多巴胺能神经元合成的多巴胺沿黑质-纹状体投射系统输送到纹状体的终末小泡内贮存，对纹状体神经元主要起抑制作用目前认为多巴胺主要抑制纹状体的乙酰胆碱递质系统的功能，若黑质输送到纹状体的多巴胺减少，导致乙酰胆碱系统的功能亢进，则出现震颤麻痹症状 在神经系统，已证实许多退行性疾病，如舞蹈病、帕金森病、Alzheimer 病等都与神经元过早、过度老化有关［4］ 。
神经细胞在衰老发展过程中，数量的变化相当复杂，有明显的种间差异、个体差异和核团差异从目前的资料看，衰老并非整个神经系统都发生普遍性的细胞减少，只是在某些特殊脑区的某类神经元程度不一的丢失，如黑质和蓝斑等核团都有明显的因年龄因素引起的神经细胞7减少［4 6］ 据一份近 15000 人（年龄大于 65 岁）的欧洲研究报告显示：从 65 岁到 89 岁，PD 的发病率从 0.6%上升到了3.5%［7 ］ 从发病率来看 PD 与老龄化有非常明显的相关性［ 8］ 据文献报道，随着年龄老化黑质致密部神经元总数逐渐减少，黑质致密部神经元的丢失可导致动物行为（动作）迟缓从本实验的Nissl 染色结果，我们也可以看出老年大鼠黑质致密部与成年大鼠相比神经元的总数明显减少（减少 30%） ，这与余资江等［9］的研究结果一致当 DA 能神经元减少达 70%以上时会引起帕金森综合征，也就是说老龄化是 PD 发病的一个重要因素，本实验结果也证实了这一点 PD 是由于中脑腹侧，特别是黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性缺失所引起的运动障碍性疾病，而研究发现老年相关性运动功能减弱与黑质细胞酪氨酸羟化酶含量自然减少有关。
TH 是包括 DA在内的儿茶酚胺合成的限速酶，同时还是脑内多巴胺能神经元的特异性标志酶，因此应用 TH 免疫技术是显示黑质致密部 DA 能神经元的可靠方法［10］ 本实验在透射电镜下观察到：DA 能神经元细胞以大、中型多角形、锥形细胞为主；在老年大鼠，DA 能神经元数量减少且胞。