《检测方法-脂肪酸AOAC996.06-2008(中文版)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《检测方法-脂肪酸AOAC996.06-2008(中文版)（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、AOAC 官方方法 996 06 食物中的总脂肪 饱和脂肪 不饱和脂肪 水解提取气相色谱法 1996 年首次实施 2001 年修订 适用于食物中脂肪的检测 注 如果吸入三氟化硼可能是致命的 A 原理 脂肪和脂肪酸 用水解的方法食品萃取 对于大多数产品用酸性水解 乳制品用碱 性水解 奶酪用二者组合 在分析过程中 加入焦性没食子酸以最小化脂肪酸氧 化降解 样品中加入内标物十一碳甘油三脂 脂肪用乙醚提取 然后在甲醇中使 用 BF3 使其甲酯化生成脂肪酸甲酯 脂肪酸甲酯是由毛细管气相色谱 GC 对内标 物 C11 0 进行定量测定 依据各种脂肪酸甲酯含量和转换系数计算出总脂肪 饱 和脂肪 酸 单不饱和
2、脂肪 酸 多不饱和脂肪 酸 含量 B 仪器 a 气相色谱仪 GC 配有氢火焰离子检测器 FID 毛细管色谱柱 分离式注 射器 能以温度调控来操控静止 上升 静止顺序的烘箱 操作条件 温度 注 射器 225 检测 285 初始温度 100 保持 4 分钟 上升 3 摄氏度每分钟 最终温 度 240 保持 15 分钟 运载气体 氦 流速 0 75 毫升每分钟 线速度 18 厘米每 秒 分离率 200 1 b 毛细管色谱柱 以 1 0 或更高的分离率分离一对相邻的脂肪酸色谱峰 C18 3 和 C20 1 和三个相邻的色谱峰 C22 1 C22 3 和 C22 4 SP2560 100m 0 25mm
3、 0 20 m c 莫琼尼尔烧瓶 脂肪萃取瓶 d 瓶塞 合成橡胶或软木 e Mojonnier 离心机盘 f Hengar 微沸腾颗粒 g 篮子 铝或塑料 h 振荡水浴箱 保持 70 80 i 蒸气浴 支持常见的玻璃器皿 j 水浴 氮流 保持 40 5 k 手动摇筛机 Mojonnier 离心机盘配套 l Mojonnier 电驱动离心机 可选 保持 600 g m 重力对流烘箱 保持 100 2 n 涡旋混合器 o 曝气管 25mm 气孔率 A 特粗 175 m p 3 个蓝色小瓶 约 11mL q 酚醛封闭顶盖 附有聚乙烯化合物衬垫 用于契合小瓶 r 聚四氟乙烯 或硅胶 隔膜 用于契合小瓶
4、 C 试剂 a 焦性没食子酸 b 盐酸 12M 和 8 3M 将 110mL 水加入 250mL 的 12M 盐酸里制得 8 3M 盐酸 室温贮存 20 25 c 氨水 58 w w d 二乙醚 适宜提取脂肪的纯度 e 石油醚 无水 f 乙醇 95 v v g 甲苯 纳米级 h 三氯甲烷 i 硫酸钠 无水 j 三氟化硼试剂 用市售的 14 BF3 溶液与甲醇制得 7 BF3 w w k 石油醚混合物 1 1 v v I 甘油三酸酯内标溶液 5 00mg mL 准确称取 2 50g 十一碳三酯 放入 500mL 容量瓶 加入 400mL 三氯甲烷混合直至溶解 用三氯甲烷定容 倒置烧 瓶至少 10
5、 次 它在冰箱中冷藏可保存一个月 2 8 m 脂肪酸甲酯标准溶液 1 脂肪酸甲酯混合标准溶液 混合溶液内含一系 列脂肪酸 包括 C18 1 cis 和 trans 和 GLC 85 一样可从 NuChek Prop Elysian MN 56028 USA 获得 或相等物 制备脂肪酸甲酯混合标准溶液 要 小心地打开玻璃瓶 将内容物转移至 3 个蓝色小瓶里 用己烷冲洗原先的瓶子 确保完全转移 将冲洗液加入到 3 个蓝色小瓶里 用约 3mL 的己烷稀释 2 十一碳酸甲酯标准溶液 十一碳酸甲酯和己烷 只用于制备单个脂肪酸甲酯标准 溶液 3 将十一碳酸甲酯 溶液从安培瓶中完全转移到 50mL 容量瓶中
6、 己烷 冲洗原先的瓶子 确保完全转移 将冲洗液加入到 50mL 容量瓶中 用己烷稀释 定容 十一碳酸甲酯标准溶液冰箱中冷藏可存一个星期 0 3 单个脂肪酸甲酯标准溶液 以下脂肪酸甲酯的标准溶液 C4 0 C6 0 C8 0 C10 0 C12 0 C13 0 C14 0 C14 1 C15 0 C15 1 C16 0 C16 1 C17 0 C17 1 C18 0 C18 2 C18 3 C20 0 C20 1 C20 2 C20 3 C22 0 脂肪酸甲酯分别从安培瓶中完全转移到 10mL 容量瓶中 用己烷冲洗安培 瓶 并加入 1mL 十一碳酸甲酯标准溶液 再用己烷定容 3mL 得到不同脂肪
7、酸 甲酯的单 标溶液 在冰箱中冷藏可保存一个星期 2 8 D 脂肪提取 脂肪提取前要仔细研磨均匀测试样品 注 由于含有未知成分 为排除干扰 在加入内标物之前需要先分析试样 如发现干扰峰 C11 内标峰面积必须在计算之前进行校正 用 2 0mL 三氯甲烷 代替内标溶液 a 食品 除乳制品和乳酪 准确称取研磨均匀样品 约含脂肪 100mg 200mg 移入 到 Mojonnier 烧瓶中 使样品尽可能深入烧瓶 加入约 100mg 焦性没食子 酸 C a 和 2mL 十一碳三酯内标溶液 C l 加入几粒沸石 再加入 2mL 乙醇 混匀 然后加入 10mL 8 3M 的盐酸 混匀 将烧瓶放入 70 8
8、0 振荡水浴中水 解 40 分钟 每隔 10 分钟振荡一下烧瓶 使粘附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶 液中 水解完成后 取出烧瓶冷却至室温 20 25 最后加入 10mL 乙醇 混匀 b 乳制品 准确称取研磨均匀样品 约含脂肪 100mg 200mg 移入 Mojonnier 烧 瓶中 使样品尽可能深入烧瓶 加入约 100mg 焦性没食子酸 C a 和 2mL 十一 碳酸甘 油三酯内标溶液 C l 加入几粒沸石 再加入 2mL 乙醇和 4mL 实验 用水 混匀 然后加入 2 0mL 氨水 混匀 将烧瓶放入 70 80 水浴中水解 10min 每隔 5min 振荡一下烧瓶 使粘附在烧瓶壁上的颗粒物混入
9、溶液中 水解完成后 取出烧瓶冷却至室温 最后加足量乙醇填充烧瓶底部 混匀 c 乳酪 准确称取研磨均匀样品 约含脂肪 100mg 200mg 移入到加标莫琼尼 尔Mojonnier 烧瓶中 使样品尽可能深入烧瓶 加入约 100mg 焦性没食子酸 C a 和 2mL 十一碳酸甘 油三酯内标溶液 C l 再加入 2mL 乙醇和 4mL 实验用 水 混匀 然后加入 2 0mL 氨水 混匀 将烧瓶放入 70 80 水浴中水解 20min 每隔 10min 振荡一下烧瓶 使粘附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中 加入 10 0 mL 12M HCl 并将烧瓶放入沸腾状态蒸汽浴并保持 20 分钟 每隔 10min
10、 振荡一下烧 瓶 从蒸汽浴中取出烧瓶 冷却至室温 20 25 C 加足量乙醇填充烧瓶底部 混匀 将 25mL 乙醚加入 a b c 的 Mojonnier 烧瓶 烧瓶加塞放置在离心机盘 将 机盘放入手动摇筛机中 用橡胶管固定 振摇 5 分钟 用乙醚石油醚混合液 C k 冲洗烧瓶塞子 冲洗液流入烧瓶 加入 25mL 石油醚 加塞 振摇 5 分钟 烧瓶 以 600 g 离心 5 分钟 注 如果不能离心 则使溶液静置至少 1 小时直至上 层澄清 用乙醚石油醚混合液 C k 冲洗烧瓶塞子 冲洗液流入烧瓶 将醚层 提取液收集到 150mL 烧杯中 并用乙醚石油醚混合液小心冲洗烧瓶沿 冲洗液流 入烧杯 用
11、氮气流蒸气浴挥发提取溶剂残留物为脂肪提取物 E 甲酯化 将提取的脂肪残留物溶解在 2 3mL 的三氯甲烷溶液和 2 3mL 的乙醚中 将混合物 转移到蓝色小瓶在 40 氮气流水浴中蒸发干燥 加入 2mL 7 的 BF3 试剂 C j 和 1mL 甲苯 C g 用带有聚四氟乙烯 或硅胶 隔膜的螺丝帽密封小瓶 将小 瓶置于 100 烘箱加热 45 分钟 每 10 分钟振摇一次 注 小瓶中的液体蒸发 意味不完全密封 此时应弃去溶液 重新制作溶液 重复整个过程 冷却至室 温 20 25 加入 5mL 水 1mL 甲苯和约 1g 硫酸钠 C i 小瓶加盖振摇 1 分钟 静置分层 然后收集上层溶液到另一装
12、有约 1g 硫酸钠的小瓶中 注 上层溶液含有脂肪酸甲酯 包括甘油三酸酯内标溶液 将脂肪酸甲酯注射进 GC 柱或转移到自动进样器的小瓶中 待 GC 分析 F GC 测定 相对保留时间 vs 甘油三酸酯内标溶液 和单个脂肪酸甲酯的响应因子可以通 过 GC 对单个脂肪酸甲酯标准溶液和脂肪酸甲酯混合标准溶液的分析得到 每个 单个脂肪酸甲酯标准溶液和脂肪酸甲酯混合标准溶液都注射约 2 L 在注射任 何测试溶液前 先用脂肪酸甲酯混合标准溶液优化色谱响应 当所有的色谱条件 都被优化后才注射测试溶液 G 计算 总脂肪是所有来源的脂肪酸的总和 为甘油三酯 脂肪酸转化为甘油三酯需要通 过甘油冷凝 每 3 个脂肪酸
13、分子 需要 1 个甘油分子 HOCH2CHOHCH2OH 本质 上说 每 3 份脂肪酸需要加进 2 份亚甲基和 1 份次甲基 计算单个脂肪酸甲酯标准溶液 C m 3 中的每种脂肪酸甲酯的保留时间 需要从 脂肪酸峰值的保留时间里减去 C11 0 峰值的保留时间 用这些保留时间去鉴别脂 肪酸甲酯混合标准溶液中的脂肪酸甲酯 a 计算每个脂肪酸响应因子 Ri 式中 Psi 为脂肪酸甲酯混合标准溶液中单个脂肪酸的峰面积 Psc11 0 为脂肪 酸甲酯混合标准溶液中 C11 0 脂肪酸的峰面积 Wc11 0 为脂肪酸甲酯混合标准 溶液中内标物的重量 Wi 为脂肪酸甲酯混合标准溶液中单个脂肪酸甲酯的重量 注
14、 表 996 06D 列有已知峰值的已知相对保留时间 在层析展开的过程中若观 察有未知峰值 用 MS 或 FTIR 等试图去鉴别未知峰值 b 计算样品中单个甘油三酯 WTG 的数量 式中 Pti 为试样中脂肪酸 i 的峰面积 Wtc11 0 为加入试样中 C11 0 内标物的 重量 g 1 0067 为甘油三酯转换为脂肪酸甲酯的内标转换系数 Ptc11 0 为试 样中 C11 0 内标物的峰面积 fTGi 为脂肪酸甲酯 i 转化为脂肪酸甘油三酯的系 数 注 如果过程精确 Wtc11 0 应为 0 010g c 计算样品中脂肪的总量 所有脂肪酸的和 为甘油三酯 包括单一不饱和 酸的 cis 和
15、trans 形式 式中 Wtest sample 为试样的重量 g d 计算每个脂肪酸 Wi 的重量 式中 fFAi 为脂肪酸甲酯转化为其相对应的脂肪酸的转换系数 e 计算样品中饱和脂肪的百分比 w w 为饱和脂肪酸 是 C4 0 C6 0 C8 0 等等的 和 f 计算样品中单一不饱和脂肪的量 w w 为 cis 形式的单一不饱和脂肪酸的 和 C16 1 C17 1 C18 1cis C20 1 等等的和 注 若样品中含有氢化脂 由于在氢化过程中形成大量同分异构体 色谱图将 会非常复杂 一般来说氢化的标志是 C18 1trans 形式峰值的存在 对于氢化脂 肪色谱图 用以下参考计算脂肪酸甲酯的峰面积 trans 峰值在 cis 峰值前流 出 因此 将 C18 1cis 和 C18 2cis 之间的峰值包括在 C18 2 峰面积的计算之内 通常 C18 1trans 峰值由一系列峰值组成 由氢化的同分异构体引起 将这些 峰值包括在 C18 1trans 峰面积内 参考 J AOAC Int 80 555 1997 82 1146 1999 修正 2002 年 3 月
