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1、荧光定量PCR技术专题 1 内容概要 1 荧光定量PCR的原理 1 荧光定量PCR的标记方法 1 荧光定量PCR解析方法 1 SYBR法实验流程及注意事项 1TIANGEN公司荧光定量产品选择指南 2 实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析 与常规 PCR技术比较 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模 板准确定量 无法对扩增反应实时检测 荧光定量PCR原理 定义 3 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 荧光定量PCR原理 常用名词概念 4 Cycle 循环数 Rn 荧光强度 B
2、aseline Log liner phase Log liner phase 荧光基团 荧光检测元件 荧光定量PCR原理 扩增曲线 5 Cycle 循环数 Rn 荧光强度 Baseline Log liner phase Log liner phase 1 前15个循环信号作为荧光 本底信号 baseline 1 荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标 准偏差的10倍 1 手动设置 大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值 进入指数期的最初阶段 1 真正的信号 荧光信号超 过域值 Threshold 荧光定量PCR原理 荧光域值 6 Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增 产物的荧光信
3、号达到设 定的阈值时所经过的扩 增循环次数 Cycle 循环数 Rn 荧光强度 Ct value 荧光定量PCR原理 Ct值 7 Cycle number Ck 104 Ck 102 Sample Log of DNA concentration 0 模板DNA量越多 荧光达 到域值的循环数越少 即Ct值 越小 0 Log模板起始浓度与Ct值 呈线性关系 荧光定量PCR原理 Ct值与模板起始量的关系 8 线性关系 扩增效率确认 检测灵敏度确认 No template control确认 PCR扩增效率 E 0 8 1 2 35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法 30Cy
4、cles内 无非特异性产物扩增 35 Cycles内无引物二聚体产生 相关系数 r2 大于0 98 荧光定量PCR反应性的确认 9 定性分析研究 杂合或纯合子鉴定 SNPs 分析等 绝对定量研究 病毒和病原菌定量分析 基因拷贝数定量 GMO定量检测等 相对定量研究 mRNA表达量分析 siRNA效果确认 基因芯 片结果验证 差异显示结果验证等 荧光定量PCR技术的应用 10 内容概要 1 荧光定量PCR的原理 1 荧光定量PCR的标记方法 1 荧光定量PCR的解析方法 1 SYBR法实验流程及注意事项 1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指 南 11 非特异性荧光标记 SYBR Green
5、I 特异性荧光标记 TaqMan Probe 常用荧光标记方法 12 SYBR Green I染料法 原理 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料 SYBR Green ISYBR Green I 13 热热 变变 性性 引物退火引物退火 延伸反应延伸反应 SYBR Green I染料法 作用机理 14 问题点 SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光 因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生 也将 同时被检测 从而可能导致检测结果不准确 SYBR Green I染料法 问题点与关键点 关键点 设计合适引物 防止非特
6、异性扩增 15 将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导 dI dT dI dT 原始图谱对数图谱 SYBR Green I染料法 融解曲线 16 融解曲线分析 单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析 出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光 因此定量不准确 SYBR Green I染料法 融解曲线 17 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便 不必设计复杂 探针 具有价格优势 优 点 容易与非特异性双链DNA结合 产生假阳性 但可以通过融解曲 线的分析 优化反应条件 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 缺 点 SYBR Green I染料法 优缺点 18 Ta
7、qman探针法 原理 5 端标记有报告基团 Reporter R 如FAM VIC等 3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 探针完整 R发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光 Taq酶有 5 3 外切核酸酶活性 可水解探针 19 Taqman探针法 工作机理 热变性热变性 引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火 延伸反应延伸反应 探针探针 报告基团报告基团 淬灭基团淬灭基团 探针探针 DNADNA聚合酶聚合酶 引物引物 R R R R R R R R 20 1 引物 探针的设计 探针Tm为68 70 30 bp 5 不能有G G可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针 扩
8、增片段 400 bp 引物Tm为59 60 2 反应参数的确定 一般为 94 10 20S 60 30 60S Taq酶5 3 外切核酸酶活性在60 最高 也可通过 温度梯度优化退火温度 3 优化引物和探针浓度 获得最小Ct值 最大信号 背景比值 引物浓度 50 900nM 探针浓度 50 250nM 4 其他与常规PCR相同 Taqman探针法 PCR体系的建立 21 3 3 淬灭基团淬灭基团淬灭基团性质淬灭基团性质建议使用的建议使用的5 5 报告基团报告基团 TAMRATAMRA荧光物质荧光物质FAM HEX TET JOEFAM HEX TET JOE等等 EclipseEclipse非
9、荧光物质非荧光物质 FAM HEX TET FAM HEX TET JOE TAMRA ROXJOE TAMRA ROX等等 Taqman探针法 荧光标记物的选择 22 高度特异性 重复性好 可进行多重定量 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记 价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 Taqman探针法 优缺点 23 不同定量方法的比较 方法优点缺点适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量 适合科研中对各种目的 基因定量分析 基因表 达量的研究 转基因重 组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 多
10、重定量 价格高 只适合特定目标 病原体检测 疾病耐药 基因研究 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 24 内容概要 1 荧光定量PCR原理 1 荧光定量PCR的标记方法 1 荧光定量PCR的解析方法 1 SYBR法实验流程及注意事项 1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指 南 25 绝对定量解析方法 26 Sample 25 绝对定量的定义 0 Log 起始浓度 与循环数呈线性关系 通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线 即得到该扩增反应存在的线性关系 0 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 27 质粒标准品的制备 PCR 目的基因克隆 质粒提取 质粒提取 ODOD值定量 将质粒梯
11、度稀释作为标准品使用值定量 将质粒梯度稀释作为标准品使用 目的基因目的基因 目的基因目的基因 目的基因目的基因 质粒 目的基因目的基因 基因组DNA 28 拷贝数的计算 待测样本浓度 ng ul OD260 40 稀释倍数 样本分子量 碱基数 324 待测样本拷贝数 copies ul 待测样本浓度 样本分子量 6 1014 倍比梯度稀释方法 1v原液 标准品i 9v稀释缓冲液 得标准品ii 1v标准品ii 9v稀释缓冲液 得标准品iii 1v标准品iii 9v稀释缓冲液 得标准品iv 1v标准品iv 9v稀释缓冲液 得标准品v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 29 q 方 法 从血液中提取病
12、毒DNA 以TaqMan探针法进行荧光定量检测 q 试 剂 TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix Probe 目录号 FP203 q 标准品 质粒标准品浓度为106 105 104 103 2个重复 设阴性空白对照 q 实验步骤 提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 荧光定量扩增 结果分析 获取血液样品中HBV DNA的精确copy数 绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 30 Samplecopies mlCt1Ct2Mean CtSTD 标准品 5 10328 1828 6428 410 16 标准品 5 10425 2525 142
13、5 190 04 标准品 5 10522 1122 4622 280 12 标准品 5 10618 6318 9218 770 10 未知样品 20 5620 4520 50 05 空白对照NoneNone 实验数据 绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 31 扩增效率 E 计算 E 10 1 斜率 1 10 1 3 17 1 2 03 1 1 03 标准曲线制作 利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y 3 17x 37 52 R2 0 9988 绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 相关系数 相关系数 R R 2 2 大于 大于0 980 98 越接近 越接近1 1
14、结果可信度越高 结果可信度越高 扩增效率 扩增效率 E E 0 8 1 2 0 8 1 2 越接近越接近1 1 越理想 越理想 32 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程 20 5 3 1726 X 37 52 QuantityUnknown 105 36 229087 copies 绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 X 20 5 37 52 3 1726 5 36 33 相对定量解析方法 34 理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件 Sample BSample BSample ASample A 目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同 RNARNA提
15、取效率相同提取效率相同 细胞起始数相同细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 35 以上条件不可能同时得到满足 必须用以上条件不可能同时得到满足 必须用 内对照基因内对照基因 管家基因 管家基因 进行校正 进进行校正 进 行相对表达量分析 行相对表达量分析 36 管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因 如 如 GAPDHGAPDH ActinActin 18S rRNA18S rRNA等等 筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选 相对定量分析相对定量分析 管家基因筛选管家基
16、因筛选 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 Sample1Sample1Sample2Sample2Sample3Sample3Sample4Sample4 实验组实验组 实验值实验值 Actin Actin GAPDHGAPDH 2 microglobulin 2 microglobulin HPRTHPRT P P P O 37 双标准曲线法 2 Ct法 相对定量分析相对定量分析 两种常用的分析方法两种常用的分析方法 38 通过标准曲线对对照样品 待测样品的目的基因及管家 基因进行定量 然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量 相对值 校正值 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析相对定量分析 双标准曲线法双标准曲线法 公式 39 优优点 分析简单简单 实验优实验优 化相对简单对简单 缺点 对对每一个基因 每一轮实验轮实验 都必需做标标准曲线线 应应用 基因表达调调控研究中最常用与公认认的两种相对对定量方法之一 相对定量分析相对定量分析 双标准曲线法双标准曲线法 检测样品管家基因H目的基因X 定量结果定量结果校正值
