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1、 产品简介 miR RiboTM miRNA mimics 是 miRNA 模拟物 化学合成的成熟 miRNA 双链 即用型 miR RiboTM miRNA inhibitor 是 miRNA 抑制物 化学修饰的成熟 miRNA 互补单链 即用型 miR RiboTM miRNA agomir 是经过特殊化学修饰的 miRNA 激动剂 适用于细胞实验 动物实验 miR RiboTM miRNA antagomir 是经过特殊化学修饰的 miRNA 拮抗剂 适用于细胞实验 动物实验 运输与保存 产品以冻干粉冻干粉冻干粉冻干粉的形式 常温常温常温常温运输运输运输运输 收到产品后 请于 20 80
2、 保存保存保存保存 冻干粉可以稳定保存一年以上 使用前请用灭菌灭菌灭菌灭菌 的的的的 RNase free H2O 或者灭菌的或者灭菌的或者灭菌的或者灭菌的 ddH2O 配制成 20 M 溶液 避免反复冻融避免反复冻融避免反复冻融避免反复冻融 尽量不要超过尽量不要超过尽量不要超过尽量不要超过 5 次次次次 建议分装保存 如果 近期不做实验 需要长期保存 产品最好以冻干粉形式保存 表表表表 1 20 M 存储液的溶解体积 miRNA nmol 0 25 0 5 1 2 5 20 溶解体积 l 12 5 25 50 100 250 1000 注 如需进行筛选试验 可选择 miR RiboTM mi
3、RNA Library 以 96 孔板密封的冻干粉或液体形式提供 使用使用使用使用前前前前须知须知须知须知 为避免外界因素 包括酶 极端 pH 或者温度条件等 导致产品降解 所有操作请严格遵循 RNA 操作规则 实验过程中 产 品最好于冰上放置 使用完毕后请于 20 80 小心保存 细胞细胞细胞细胞实验使用实验使用实验使用实验使用方法方法方法方法 为了降低细胞密度 试剂用量 转染效率等因素导致的孔间差异 保证实验的可靠性和可重复性 一般建议 a 每次转染实验时 每个转染样品至少设置3个以上复孔 b 接种细胞时 保证每孔接种的细胞数量尽量相同 尽量使细胞在各孔的表面平均分布 1 转染转染转染转染
4、浓度浓度浓度浓度 miRNA 产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异 锐博生物推荐的 miRNA mimics 转染浓度是 50nM miRNA inhibitor 转染浓度是 100nM 客户可根据实验具体情况优化转染浓度 优化的范围建议 10 200nM 注 miRNA inhibitor 往往需要用到较大的用量才能观察到预期的抑制效果 相当于 miRNA mimics 的几倍用量 这可 能与 miRNA inhibitor 作用机制及作用效率有关 因此 当使用推荐的转染浓度没有获得预期效果 可以适当选择更高的 浓度 表 3 或选择 antagomir 无需转染试剂 进行实验 2
5、转染步骤转染步骤转染步骤转染步骤 以lipofectamineTM 2000 简称lipo2000 转染miRNA mimics于24孔板为例 其他规格容器转染请参考表2 1 转染前一天 接种适当数量的细胞至细胞培养板中 每孔中加入不不不不含含含含抗生素抗生素抗生素抗生素的培养基 使转染时的细胞密度能够达到 30 50 不同细胞生长速度不一样 因此 接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验 注意 转染时 细胞密度是影响 转染效率的关键因素之一 细胞生长过度会削弱细胞活力 从而降低细胞的转染效率 2 对于每个转染样品 按如下步骤准备 mimics lipo2000 混合液 miRNA 产品使用说明
6、广州市锐博生物科技有限公司 E mail support 网址 Tel 400 686 0075 a 稀释 miRNA mimics 用 50 l 不含血清培养基 Opti MEM v2 稀释 25pmol miRNA mimics 加入细胞中的 RNA 终 浓度 50nM 轻轻混匀 室温孵育 5min b 稀释 lipo2000 用 50 l 不含血清培养基 Opti MEM v2 稀释 1 l lipo2000 轻轻混匀并室温孵育 5 min c 将 a 与 b 轻轻混匀 室温孵育 20min 溶液可能会有浑浊 但不会影响转染 注意 稀释好的 lipo2000 长时间放置可能导致转染试剂活
7、性的降低 应尽量在 25min 之内与稀释好的 mimics 混合 另在 混合试剂时 请勿剧烈吹打或振荡 手指轻弹管壁即可 过度用力可能会破坏脂质体的结构 以及 miRNA mimics lipo2000 混合物的形成 3 将 miRNA mimics lipo2000 混合液加入含有细胞以及培养液 v1 的培养孔中 轻轻混匀 4 将培养板置于 37 的 CO2培养箱中培养 24 96h 检测时间与研究实验有关 培养 4 6h 后 可以将孔里含有 mimics lipo2000 混合液的培养基移去 更换新鲜培养基 也可以进行其他必要的特殊处理 如加药处理 表表表表 2 使用 lipofecta
8、mine2000 invitrogen 转染 miRNA 产品用量参考 V1 完全或不完全培养基 v2 Opti MEM I 无血清 无抗生素 转染专用 每孔中总体积 v1 v2 v2 终浓度 miRNA 产品 lipo2000 孔 96 well 100 l 50 l 25 l 25 l 100nM 0 5 l 0 25 l 100 l 50 l 25 l 25 l 50nM 0 25 l 0 25 l 100 l 50 l 25 l 25 l 30nM 0 15 l 0 25 l 100 l 50 l 25 l 25 l 20nM 0 1 l 0 25 l 100 l 50 l 25 l
9、25 l 10nM 0 05 l 0 25 l 24 well 500 l 400 l 50 l 50 l 100nM 2 5 l 1 l 500 l 400 l 50 l 50 l 50nM 1 25 l 1 l 500 l 400 l 50 l 50 l 30nM 0 75 l 1 l 500 l 400 l 50 l 50 l 20nM 0 5 l 1 l 500 l 400 l 50 l 50 l 10nM 0 25 l 1 l 12 well 1mL 800 l 100 l 100 l 100nM 5 l 2 l 1mL 800 l 100 l 100 l 50nM 2 5 l 2
10、l 1mL 800 l 100 l 100 l 30nM 1 5 l 2 l 1mL 800 l 100 l 100 l 20nM 1 l 2 l 1mL 800 l 100 l 100 l 10nM 0 5 l 2 l 6 well 2mL 1500 l 250 l 250 l 100nM 10 l 5 l 2mL 1500 l 250 l 250 l 50nM 5 l 5 l 2mL 1500 l 250 l 250 l 30nM 3 l 5 l 2mL 1500 l 250 l 250 l 20nM 2 l 5 l 2mL 1500 l 250 l 250 l 10nM 1 l 5 l
11、实验参考用量示例 广州市锐博生物科技有限公司 E mail support 网址 Tel 400 686 0075 3 效果检测效果检测效果检测效果检测 转染完成 24 72 小时后均可进行检测 最佳检测时间与使用的细胞类型及研究的 miRNA 分子有关 1 miRNA mimics inhibitor 作用效果的检测往往通过功能方面检测 常用通过 Western Blot 等方法检测所调控基因的转录 后水平是否发生相应改变 或检测下游功能是否发生相应变化等 2 通过构建报告载体来验证 miRNA mimics inhibitor 的作用 锐博生物可提供空载体及部分重要基因的报告载体 3 通过
12、相应基因的 siRNA 来验证 miRNA mimics inhibitor 的作用 更多检测方法请 E mail support 动物动物动物动物实验使用方法实验使用方法实验使用方法实验使用方法 动物实验分为局部给药和全身给药 具体用量请参考表 4 更多信息请联系 support 表表表表 3 细胞实验 miRNA mimics inhibitor antagomir 用量参考 部分文献报道antagomir不用转染试剂 Reference miRNA Cell Mimics Inhibitor Antagomir Meister G et al RNA 2004 miR 21 HeLa S
13、3 40 nM 120 nM N A Poy M et al Nature 2004 miR 375 MIN6 200 nM 200 nM N A Lim L et al Nature 2005 miR 1 miR 124 HeLa 100 nM N A N A Chen J F et al Nat Gen 2006 miR 1 miR 133 C2C12 200 nM 200 nM N A Schratt G et al Nature 2006 miR 134 Primary neurons 10 M 20 M N A Ying Shan et al Gastroenterology 200
14、7 miR 122 Huh 7 WT CNS3 50nM N A 50nM Brian D et al Molecular Endocrinology 2007 miR 206 HeLa MDA 231 MCF 7 50 nM N A 20 50 nM R Luthra1 et al Oncogene 2008 miR 196a Breast cancer 40 nM N A N A Hua Zhua et al Biochem Pharmacol 2008 miR 27a miR 451 A2780 100nM N A 100nM Alla Musiyenko et al J Mol Med
15、 2008 miR 126 miR 126 LNCaP 10 30nM N A 10 30nM Jia Yu et al PNAS 2008 miR 184 miR 205 HeLa HEKs 10nM N A 1 M Federica Felicetti et al Cancer Research 2008 miR 221 miR 222 Me665 1 N A N A 50 250nM Relja Popovic et al Blood 2009 mir 196b bone marrow cells N A N A 100nM Pascal Pineau et al PNAS 2010 m
16、iR 221 miR 222 hepatocellular carcinoma derived N A N A 100 M 广州市锐博生物科技有限公司 E mail support 网址 Tel 400 686 0075 表表表表4 动物实验antagomir用量参考 Reference miRNA Animals Delivery Doses Volume injection times Detection Kr tzfeldt J et al Nature 2005 miR 122 miR 192 6 week old mice tail vein injections 80 mg per kg body weight 0 2 ml per injection 1 to 3 consecutive days 24 h after the last injection Jan Kr tzfeldt et al Nucleic Acids Research 2007 miR 16 6 week old mice Intracerebral injections 800 ng per m
