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1、2016 7 相关知识 1 顺式作用元件 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达 的序列 包括启动子 增强子 调控序列和可诱导元件等 作用是参与基因表达的调控 2 反式作用因子 转录因子 能直接或间接地识别或结 合在各类顺式作用元件核心序列上 参与调控靶基因转录 效率的蛋白质 3 报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因 4 cDNA文库 以mRNA为模板 反转录合成双链cDNA 各cDNA分子分别插入载体形成重组子 再导入宿主细 胞克隆扩增 这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文 库 基本原理 真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的 功能上也相互 独立的结构域组成的结构域 转录激活结
2、构域 AD activation domain DNA结合结构域 BD DNA binding domain 转录激活因子 BD 识别DNA上特定序列 转录激活域定位调控 基因的上游 AD 与转录复合体其他成分作用 从而启动所调节基因的转录 两个结构域分开时仍具有功能 但不能激活转录 只有他们 以适当 途径在空间上相互靠近时 才能具有转录因子活性 激活报告基因的表达 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达 探 测蛋白 蛋白的相互作用 酵母双杂交原理示意图 X DBD Reporter gene Prey Bait AD Y Expression UAS nDNA结合域 DNA BD
3、N端1 147氨基酸 可识别并结 合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列 UAS n转录激活域 AD C端786 881氨基酸 通过同转录机 制的其它成分之间的结合以启动上游激活序列 UAS 下 游的基因转录 1 构建质粒 诱饵蛋白不发生自激活 2 转化酵母细胞 本身不表达GAL4 3 阳性筛选 1 1 BD plasmid 靶基因 蛋白A基因 按正确的读码 结构和取向克隆在GAL4的BD之后 筛选标志 TRP 2 AD plasmid 蛋白B基因按正确阅读框 克隆到GAL4的AD片断 之后 筛选标志 LEU2 1 双载体转化能合 成亮氨酸和色氨酸 Trp Leu 2 两种重组质粒共同转化酵母菌 HF
4、7c 3 筛选观察 2 筛选蛋白A和蛋 白B能相互作用的双载 体转化子 Trp Leu His 酵母细胞 cDNA文库 诱铒蛋白基因 多克隆位点 DNA BD 载体 AD 载体 转化 转化 酵母细胞 筛选平板 生长菌苔 筛选平板 生长菌苔 同一个三重筛选平板 克隆 诱饵与靶蛋白相互作用 鉴定 半乳糖苷酶 酵母双杂交系统的应用 1 发现新蛋白和蛋白的新功能 2 研究抗原和抗体的作用 细胞内 3 检测已知蛋白质之间的相互作用 4 确定未知蛋白之间的相互作用 5 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理 应用举例 应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究 实验步骤 1 诱饵质粒构建 扩增诱饵
5、蛋白基因 与质粒载体连接 重组载体鉴定 诱饵蛋白自我转录激活检测 将诱饵质粒转入酵母菌株 若转化了诱饵质粒的酵母菌落表达 半乳糖苷酶 则可 使底物X Gal 变蓝 说明存在自激活 假阳性 否则无 自激活 2 人胎脑cDNA质粒构建 3 酵母双杂交筛选人胎脑 cDNA 文库 人胎脑 cDNA文库转化诱饵酵母菌及初步筛选 菌液 分别 涂布于培养基 A Leu Trp B Leu Trp His A平板 上的克隆进行计数 根据稀释度计算转库效率 转库效率只有 达到 1X107 1X108cfu gDNA以上才能进行文库的筛选 以保 证不会丢失阳性克隆 半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步筛选 从B Le
6、u Trp His 平板上挑取 35 个单克隆进行 半乳糖 苷酶克隆转移滤纸实验 变蓝色的为阳性克隆 3 阳性杂交克隆的质粒抽提及一对一验证 对上述筛选的 阳性克隆进行质粒抽提 再次进行抗性筛选和质粒抽提后 一对一与诱饵质粒 p GB FAM172A共转酵母细胞 Y190 验 证 4 再次阳性者抽提质粒进行测序及生物信息学分析 利用 NCBI 对测序所得到的序列进行 BLAST 比对分析 对 10个阳性克隆相应的质粒进行测序后 通过 BLAST在 GenBank数据库中对应 6个不同的基因 编码6种已知的 蛋白质 RTCD1 MOCS2 A2M KCNIP1 BTBD2 和TOX2 根据Gen
7、Bank数据库及相关文献获得了它们的 功能信息 其中 A2M与糖尿病血管病变密切相关 也进 一步提示 FAM172A参与了糖尿病大血管病变的发病 n 1 用体内实验来研究蛋白质的相互作用 方法精确 不受外界影响 易于操作 n 2 所有操作均在核酸水平进行 无需纯化大量的蛋白 质 可以精确测定蛋白质的弱相互作用 n 3 运用范围较大 酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以 是完整的蛋白质 也可以是蛋白质的一个功能区 可以大 到一个完整的肿瘤抑制蛋白 也可以小到一个约22个氨基 酸的多肽 局限性 1 它并非对所有蛋白质都适用 有其原理决定 融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内 发生的 而表达的融
8、合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测 的前提条件 2 假阳性较多 某些诱饵蛋白具有自身激活性质 如AD融合靶蛋白有DNA的特异 结合 则可单独激活报告基因的表达 双杂交系统的得到的阳性结果 一定要通过其它的实验手段来验证 3 阴性干扰 两个蛋白本应发生相互作用 但报告基因不表达或表 达程度甚低以至于检测不出来 蛋白间的相互作用较弱 应选择高敏感的菌株或多拷贝载体 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内 4 融合蛋白的表达对细胞有毒性 应选择敏感性较低的菌 株或拷贝数低的载体 在酵母双杂交的基础上 又发展出了酵母单杂 交 酵母三杂交技术 它们被分别用于核酸和 文库蛋白之间的研究
9、三种不同蛋白之间的互 作研究 酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的基本原理 通过 观察酵母细胞内报告基因的表达状况 研究DNA与蛋白 质之间的相互作用 n设计含目的基因 诱饵 和下游报告基因的质粒 将其转 入酵母细胞中 n 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达 的cDNA文库质粒转化入同一酵母细胞中 n 若文库蛋白与目的基因相互作用 可通过报告基因的表 达将其筛选 n实验过程简单 耗时短 能直接识别并找出与特异顺 式作用元件相结合的蛋白质及其编码序列 而不需通过制 备纯化蛋白或抗体等繁琐的生化手段来建立这种相互作用 关系 n酵母属于真核生物 且蛋白质处于自然构象 避 免了体外研
10、究的不足 n与内源性的表达激活因子发生相互作用 n假阳性 插入的靶元件有可能不需要转录激活因子就可 以直接激活报道基因的表达 n假阴性 融合蛋白有毒性 不能稳定地表达 错误折叠 不能准确定位于酵母细胞核内 DNA 结合位点被封闭 n酵母细胞内蛋白修饰缺乏 TF 介导蛋白质相互作用的第三种因子 可以是蛋白质 DNA RNA或小分子配体 两个蛋白之间通过第三者发生相互作用 用来检测蛋白质与RNA 蛋白 小分 子配体间相互作用 酵母三杂交技术 1 研究RNA 蛋白质间相互作用 2 研究小分子受体与蛋白质受体间相互作用 在该系统中 第三个杂交小分子为Dex 地塞米松 FK506 偶联体 利用已知的地赛
11、米松受体和FK506 受体FKBP12 分别构建AD 和BD 融合蛋白 三种分子相互作用后 成功 的激活了报道基因的表达 而当单体FK506 分子引入时 由 于竞争性结合FKBP12 导致三元复合物无法形成 几乎完 全抑制了报道基因的表达 3 研究复杂的蛋白 蛋白间相互作用 不能用来研究位于细胞核外的RNA分子 许多蛋白质需要辅因子作用使其结合到它们的对应的RNA 上 然而这些辅因子可能定位于细胞的其他区域不能在核 中发挥作用 假阴性 不适用经过转录后修饰才能与蛋白质结合的 RNA分子 n细胞内进行 n核酸水平 n操作简单 n假阳性 n假阴性 n对核外分子无用 n对需要进行复杂转录后修饰的分子无用 谢谢 请多多指教O O
