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1、染色体标本制备及核型分析 染色体核型分析 1 一 名词解释 二 染色体标本制备 三 染色体核型分析 实验耗材 前期处理 实验步骤 玻片标本质量评价 计数标准 合格指标 染色体核型排列 核型检测的可重复性 2 一 名词解释 核型 分裂相 一个体细胞中的全部染色体 按其大小 形态特征 顺序排列所构成的图像 小鼠 40 XY 40 XX 人类 46 XY 46 XX 细胞分裂过程中每个时期的细胞形态特征 包括细胞的 总体形状和遗传物质的变化 3 一 名词解释 数量变异 性染色体丢失 增加 近端着丝粒染色体三体 中期 分裂相 核型 结构变异 缺失 重复 倒位 易位 4 二 染色体标本制备 实验耗材 仪
2、器设备 超净工作台 恒温培养箱 恒温水浴箱 离心机 光学 显微镜 刻度离心管 乳头吸管 棕色试剂瓶 载玻 片 吹风机 玻片架 染色缸 主要试剂 秋水仙素 低渗液 卡诺氏固定液 吉姆萨染液 胰 酶 1N HCl 1N NaOH MEF培养基 PBS 5 二 染色体标本制备 前期处理 样品要求 对数期生长 状态良好 紧密度高 折 光性好 细胞量 T25 60 mm平皿 差速贴壁法去除MEF KSR培养体系除外 终止培养前1 2小时 加入秋水仙素 100ug ml 最终浓度为0 1 0 2ug ml 作用 破坏纺锤体 防护 有剧毒 无挥发性 因素 时间 浓度 6 7 二 染色体标本制备 固定 细细胞
3、收获获 制片 预预固定 低渗处处理 实验步骤 8 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 消化并收集细胞至离心管 吹打成单细胞悬液 250 g 5 min离心 弃上清 实验步骤 9 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 加入37 预热的低渗液 0 075 mol L 5 ml 吹 打至均匀 37 水浴15 20 min 实验步骤 10 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 加入37 预热的低渗液 0 075 mol L 5 ml 吹 打至均匀 37 水浴15 20 min 实验步骤 配制 0 075 mol
4、 L KCl溶液 作用 低渗作用 因素 时间 温度 浓度 11 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 离心弃上清 将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔 地重悬细胞 沿管壁缓慢加入固定液0 5 1 0 mL 边 滴加边震荡均匀 静置5 min后离心弃上清 12 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 离心弃上清 将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔 地重悬细胞 沿管壁缓慢加入固定液0 5 1 0 mL 边 滴加边震荡均匀 静置5 min后离心弃上清 配制 甲醇 冰乙酸 3 1 现用现配 作用 固定并维持染色体结 构的完整性
5、 防护 甲醇 毒性 冰乙酸 刺激性和腐蚀性 13 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 1 加入3ml固定液 静置30min 离心弃上清 2 再次加入3ml固定液 吹打均匀并静置30min 14 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 离心弃上清液 根据细胞数量情况 加入1 2 mL固定 液 吹打细胞制成悬液 悬液呈微白色时为最佳 15 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验内容 用滴管吸取细胞悬液 高空滴在冰冻玻片上 立即在 酒精灯的火焰下过火几次 置80 烤箱中烤片2h 16 二
6、 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 用滴管吸取细胞悬液 高空滴在冰冻玻片上 立即在 酒精灯的火焰下过火几次 置80 烤箱中烤片2h 要求 洁净 冰冻 处理 逐片清洗 洗洁精 超声波 自来水 纯水 95 乙醇浸泡24 h 纯水逐片 刷洗 放置于装有纯水的器 皿中 4 保存 17 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 预热胰蛋白酶消化25 30s Giemsa染色10min 清水冲洗染液 用吹风机吹干 18 二 染色体标本制备 细细胞收获获 制片 固定 预预固定 低渗处处理 实验步骤 预热胰蛋白酶消化25 30s Gi
7、emsa染色10min 清水冲洗染液 用吹风机吹干 要求 0 25 pH6 8 7 2 作用 去除染色 体上的蛋白质 便于染色 配制 Giemsa原 液 磷酸缓冲液 pH 7 4 1 9 现用现配 19 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 玻片颜色 蓝紫色 玫红色 着色浅 解决方案解决方案 配制新的染液 适当提高胰酶消化玻片的时间 20 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 细胞密度 过密 适中 过稀 解决方案解决方案 制备玻片时 对每一个样品都先进行试片 并在镜下观 察细胞密度 从而调整悬液密度 21 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相密度 足够 稀少 解决方案解决方案适当提高固
8、定液中冰醋酸比例 制备较多的玻片 22 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 紧密度 过密 适中 过散 解决方案解决方案 过密 适当提高固定液中冰醋酸比例 过散 适当降低固定液中冰醋酸比例 23 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 过密 适中 过散 解决方案解决方案 过密 适当提高固定液中冰醋酸比例 增加滴片高度 过散 适当降低固定液中冰醋酸比例 减小滴片高度 24 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 解决方案解决方案 尽量将细胞吹打成单细胞悬液 滴片时勿重复滴加同一区域 重叠 25 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 染色体形态 适中 短小 过长 扭
9、曲交联 消化过度 26 三 染色体核型分析 计数标准 合格指标 分裂相需完整独立 染色体不过于松散 周围无其他 距离很近的分裂相 染色体形态适中 不过度短小或纤长 染色体彼此间 无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分 染色体G显带普遍较清晰 质检人员能够精确的判断核 型位置 计数30个分裂相 正常比例 50 数量是否异常 暂不涉及核型排列 结构是否异常 27 三 染色体核型分析 染色体核型排列 28 三 染色体核型分析 染色体核型排列 29 三 染色体核型分析 染色体核型排列 30 三 染色体核型分析 染色体核型排列 31 正常 正常 4646 XYXY 32 大大Y Y 4646 XYXY Y Y 1818 33 小小Y Y 4646 XYXY Y Y GG组组 34 三 染色体核型分析 核型检测的可重复性 35 染色体标本制备及核型分析 36
