《动力性肺动脉高压犬肺动脉PCNA及α┐平滑肌肌动蛋白的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动力性肺动脉高压犬肺动脉PCNA及α┐平滑肌肌动蛋白的表达（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1动力性肺动脉高压犬肺动脉 PCNA 及 平滑肌肌动蛋白的表达作者：崔勤，杨景学，赵建斌，朱海龙 【关键词】高血压 关键词: 高血压，肺性;疾病模型，动物;血液动力学; 增殖细胞核抗原;肌动蛋白类 摘要: 目的探讨平滑肌细胞增殖在动力性肺动脉高压形成中的作用. 方法利用降主动脉 左下肺动脉分流建立的幼犬动力性肺动脉高压模型，取 90d 肺组织病理切片，应用鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、 -平滑肌细胞肌动蛋白抗体（-actin） 、及 Dako二抗免疫组化检测，图像分析仪对所得结果进行分析，然后计数高倍镜下平滑肌细胞总数及 PC-NA 细胞阳性数，计算细胞增殖指数.结果分流犬左下肺动脉中
2、膜 -actin 免疫组化染色呈强阳性表达，右下肺动脉弱阳性，而对照组均呈阴性;分流犬左下肺动脉 PCNA 阳性信号表达明显多于右肺动脉，而右肺动脉及左上肺动脉仅有少量表达; 增殖指数左下肺动脉内膜为 33%，中膜 11%，外膜 7%，右下肺动脉仅为少量.结论平滑肌细胞增殖参与实验犬动力性肺动脉高压形成过程并与肺动脉压力增高程度和肺血管重构改变一致. 2Keywords:hypertension，pulmonary;diseasemodels，animal;hemodynamics;proliferatingcellnuclearantigen;actins Abstract:AIMToexp
3、loretheactionofpulmonaryarterysmoothmusclecellproliferationinformationofdynamicpul-monaryhypertension.METHODSUsingthepulmonaryhy-pertension（PH）modelofshuntfromdescendingaorta-to-leftlowerpulmonaryartery，thesampleofthelungtissueinshuntdogswasobtainedonthe90thdaypostoperation.TheexaminationofPCNAand-a
4、ctinwasdonebyimmunohis-tochemistrymethodusingPCANand-actinantibodies.Theslicesofpulmonarytissuewereobservedunderhighpowermicroscope，andthedatawereanalyzedbyimagepatternanalysor.ThepositivecellsofPCNAand-actinwererecordedandthepercentagewascalculated.RESULTSEx-pressionof-actininleftlowerpulmonaryarte
5、rywasstrongpositiveandrightpulmonaryarterymilderthanthatinleftpulmonary，andcontrolgroupwasnegative.Thepositiveex-3pressionofPCNAinleftlowerpulmonaryarterieswasmorethanthatofrightlungandupperleftlobe.Theindexofcellproliferationwas33%inintima，11%inmediaand7%inad-ventitiaofleftlowerpulmonaryarteriesres
6、pectively，andon-lyafewinrightlung.Thereisnopositiveexpressionincon-trolgroup.CONCLUSIONSmoothmusclecellproliferationmightplayapartintheformationofdynamicpulmonaryhy-pertensioninexperimentaldogs，andmaybeidenticalwiththeelevationofpulmonarypressureandremodelofpul-monarybloodvessel. 0 引言 肺动脉高压往往伴随肺动脉结构
7、改变，而肺动脉的病理改变又是肺动脉压力持续上升的形态学基础，其最基本的病理改变既是平滑肌细胞的增殖肥大.增殖细胞核抗原（PCNA） ，平滑肌肌动蛋白（-actin）是反映细胞增殖状态的重要生物学指标.我们利用免疫组化技术观察平滑肌细胞增殖在肺动脉高压发病过程中的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 4杂种幼犬，年龄 23mo，体质量 3.54.5kg，雌雄不拘，分两组:组 1 为分流组（n=12） ，全部行左侧开胸，降主动脉向左下肺动脉分流术，术后 90d 放血处死，取肺组织行病理学检测.鼠抗人PCNA（1100）抗体，鼠抗人 -actin（ 1100）抗体和生物素化羊抗鼠（1200）抗体，均
8、为博士德公司产品，微波修复液 DAB显色液，0.01mmolL-1PBS 液为本院病理科配制.图像分析仪（LeicaQ570c）为德国产品. 1.2 方法 利用降主动脉左下肺动脉分流建立的幼犬动力性肺动脉高压模型1 ，取 90d 肺组织病理切片，用免疫 S-P 两步法进行. 石蜡切片脱蜡至水后 0.01molL-1pH7.4PBS 液洗涤 5min3 次（下同） ，30mLL-1H2O2 封闭 30min，置于微波处理液中微波处理 10min，冷却，洗涤，加一抗 4 过夜，37 水箱温浴 60min，生物素化二抗（羊抗鼠）37，30min，DAB5mg+H2O25mL 显色 510min 后水
9、洗，苏木素衬染 30s，盐酸酒精分化，氨水返蓝，水洗，脱水、透明、常规封片镜检.每张切片随机选取 5 个不同部位，计数每个高倍镜下平滑肌细胞总数及 PCNA 细胞阳性数计算细胞增殖指数.空白对照实验:PBS 替代第一抗体，替代对照实验 :小牛血清替代第一抗体.统计学处理: 数据以百分数（% ）表示，统计学处理用方差分析（2）处理 . 52 结果 2.1PCNA 免疫组化结果 手术后 90d 可见分流犬左下肺动脉内膜细胞核内出现较多棕黄色染色，中膜较少，右肺动脉及左上肺动脉仅有少量表达，空白对照组和替代对照组呈阴性表达（P0.01，Tab1）.表 1 分流犬不同部位肺动脉细胞增殖指数（略） 2.
10、2-actin 免疫组化结果 -actin 免疫组化染色显示分流犬左下肺动脉中膜 -actin 呈阳性表达，对照组阴性表达.手术后 90d 可见分流犬左下肺动脉平滑肌细胞胞质内出现较多棕黄色染色（P0.01） ，右肺动脉及左上肺动脉仅有少量，空白对照组替代对照组呈阴性表达. 2.3 ，型胶原纤维免疫组化结果 分流后 90d，分流犬肺动脉壁内、两型胶原均有增多，左下肺动脉多于右下肺动脉，肺间质内也可见到胶原纤维的 出现 . 3 讨论 正常情况下肺动脉中各种纤维含量较少，平滑肌细胞处于“休眠期” 2 ，-actin 表达阴性或弱阳性.当其受到一定刺激时，内皮细胞及激活的血小板细胞释放有关因子如内皮
11、依赖生长因子6（EDGF） 、血小板依赖生长因子（ PDGF）及内皮素（ET）等，促进血管平滑肌迅速增殖，而且具有成纤维细胞样功能产生胶原纤维和弹力纤维，用以适应改变的血管张力3.平滑肌肌动蛋白 -actin，作为平滑肌细胞的标记物，对于了解肺动脉平滑肌细胞增生情况有重大意义.PC-NA 是一种核蛋白质、DNA 聚合酶辅助因子4.PC-NA 的含量在细胞周期的 G1 期开始增加， S 期达高峰，G2， M 期降低，G0 期测不到，其量的变化与 DNA 合成一致，静止细胞 PCNA 表达极低，增殖活跃细胞 PCNA 表达明显增加5 .Speir 等 6认为，引起细胞增殖的多种信号途径汇聚在 G1
12、/S 期交界处并具有一个引起 DNA 复制的共同机制，PCNA 表达为细胞进入细胞周期进行 DNA 复制和分裂增殖所必需，应用反义 PCNA寡核苷酸能有效抑制平滑肌细胞 PC-NA 表达和平滑肌细胞增殖.因此，PCNA 是反映细胞增殖的另一重要生物学指标.Liu 等7应用流式细胞仪对缺氧小牛肺动脉平滑肌细胞进行检测发现在缺氧 12h时，肺动脉平滑肌细胞 G2/M 相明显增加，但在 2448h 时 S 相缩短，24h 缺氧肺动脉平滑肌细胞 PCNA 较正常肺动脉增强，提示缺氧首先抑制然后刺激肺动脉平滑肌细胞增生并引起肺动脉平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化.Mitchill 等 8与 Botne
13、y 等9在严重无法解释的肺动脉高压患儿肺组织中，应用型前胶原抗体进行的免疫组化检测表明在该类患儿肺小动脉中膜内膜均有大量前胶原合成，而在正常人群的肺动脉中是不存在的.我们实验中的分流犬左下肺动脉管壁内膜和中膜明显增厚，PCNA 阳性率增加，7平滑肌细胞主要为合成表型，部分细胞呈退化迹象;胶原纤维丰富，分布较广，在血管中、内、外膜均可见到，其排列不整，-actin 在中、内膜均表达阳性，以中膜为主;PCNA 表达主要在内膜为多，这与低氧所造成的肺动脉改变有着明显的不同10-13 ，低氧所致的PCNA 表达多位于外膜，而产生这一差异的机制尚不清楚，可能与肺动脉高压形成原因不同有关.低氧性肺动脉高压
14、其成因在于低氧引起的肺血管痉挛，长期刺激造成多种细胞因子发生变化;动力性肺动脉高压的产生的缘于来自体动脉的高压血流，造成肺血管及其血管内的血液成分受到的切应力发生改变，一方面，高压血流直接作用于一直处于低压状态的肺血管，并在其中产生湍流，导致肺血管内皮损伤;另一方面，在高切应力作用下，引起血小板的快速释放反应，血小板聚集，释放促血管收缩物质.两种原因同时起步，导致肺血管管壁增厚，管腔狭小或闭塞.管壁僵硬，血管阻力增加，导致肺动脉压力进一步升高. 肺动脉高压导致血管平滑肌 SMC 的大量增殖.是肺动脉高压患儿出现肺血管改变的主要原因之一.从实验犬不同部位肺血管 PCNA 表达中我们可以看出，血管
15、内不同压力改变，对 PCNA 的表达产生重大影响.此结果与 Jones 等14应用免疫组化方法对持续性肺动脉高压患者肺组织活检结果相一致，即不同肺动脉压力改变，产生不同肺血管改建，分流犬左下肺动脉主要接受分流来的高压体动脉血，进而迅速产生肺动脉高压并出现病理性改变，PCNA 表达强阳性，而右下肺动脉主要接受来自右心室的低压血流，尽管血流有所增多，8但肺循环血流动力学改变不著，病理改变也不显著，PCNA 呈弱阳性表达.Everett 等15对年龄为 42d 的 SD 大鼠通过建立主动脉与腔静脉间分流造成肺动脉血流增多，而肺动脉压力并无明显升高动物模型也出现相同结果. 参考文献: 1CuiQ，Zh
16、uHL，YangJX，LiuXZ ，ZhaoJB.TheestablishmentoftheexperimentalpartialpulmonaryhypertensionmodelinpuppiesJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，1999;20（ 4）:328-330. 2LiJ，ZhouAQ.Thechangesofpulmonaryarteryendothelialfunctionandcostructureofcongeitalheartdiseaseswithpul-monaryhypertensionJ.GuowaiYixueErkexueFence（JFor-eignMedPediat） ，1994;21（6 ）:288-290. 3ChengLZ.HistologyM.2nded.Beijing
