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1、Red ET同源重组技术 2015年3月25日 内 容 一 什么是Red ET同源重组 二 技术的特点 三 作用机制 四 功能元件 五 操作流程及关键因素 六 在基因工程中的主要应用 七 新技术的发展 八 在其他细菌中的应用 遗 传 重 组 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡 这样才能使生物 体得以生存并能世代相传 繁衍不息 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生 一种是突变 一种是遗传重组 重组可分为四类 DNA序列 蛋白质因子 狭义遗传重组 涉及到DNA分子内断裂 复合的基因交流 遗传重组与重组DNA技术 异常 广义遗传重组 任何造成基因型变化的基因交流过程 一 什么是R
2、ed ET同源重组 1 概念 Red ET重组是新近出现的一种利用来自E coli中 噬菌体的重组酶 Red Red 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE RecT 进行基因同源 重组的DNA工程技术 2 原理 首先重组酶沿5 3 方向消化双链DNA 露出粘性末端 15 50bp 随后重组酶介导单链退火修复 single strand annealing 即载体 和插入片段的黏性末端 15 50bp 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质 粒 转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒 3 特点 Red同源重组技术具有同源序列短 15 50bp 重组效率高 操作 简单 快速的特点 4 应用 这
3、种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除 敲入 点突 变等操作 无需使用限制性内切酶和连接酶 此外 这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上 目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 大大推动功能基因组研究的发展 g b a l phage ET Rac phage u Rac recE recT 操纵子 red 操纵子 操纵子中的重组酶 Red Red 或者RecE RecT 协同配合完成重组作用 u recE red 5 3 dsDNA核酸外切酶 u recT red ssDNA结合和退火蛋白 u red 防止 E
4、 coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片 段的消化 噬菌体的pL操纵子示意图 Reda RecE Red同源重组原理示意图 Single strand annealing Strand invasion 3 5 Digestion Binding 3 5 Redb RecT Repair Replication Selection RecE RecT和Red Red 两重组系统的差异 u 线状DNA 线状DNA 重组 选用RecE RecT重组酶系统 u 线状DNA 环状DNA 重组 选用Red Red 重组酶系统 u 根据需要选择含不同抗生素抗性基因 Ampr Hygr Tetr
5、 和不同 的诱导型启动子 pBAD pTet 的重组酶系统表达质粒 质粒 l pSC101 BAD gbaA amp l pSC101 BAD gbaA tet l pSC101 BAD gbaA hyg l pSC101 Tet gbaA tet l pSC101 BAD ETgA tet l pSC101 Tet ETgA amp RecE RecT和Red Red 两重组系统对不同类型底物重组效率的差异 Red同源重组技术相关文献 Nature Genetics 1998 Nature Biotechnology 2000 1 不依赖RecA蛋白 在重组酶系统 Red Red 或 Rec
6、E RecT 的相互配合下 含短同源臂 15 50bp 的供体 DNA分子能直接重组到受体DNA分子上 实现替换 插入 删 除 突变等 2 不受靶标DNA分子大小的限制 3 不受内切酶切位点的限制 4 精确性 不依赖RecA蛋白 减少了引入非预期的突变 缺失 替换等的几率 5 简便快捷 省去了中间质粒的构建 减少实验步骤 缩 短实验周期 二 Red ET同源重组技术的特点 三 Red ET重组的作用机制 Red ET重组链入侵模型 1 链入侵模式 Red ET同源重组链退火模型 2 链退火模型 四 Red ET重组中的功能元件 1 Red Red 和Red Red 以三聚体的形式形成 漏斗型
7、活性的蛋白 5 3 外切酶 活性 Red 结构 A 和与DNA相互作用的模式 B 图片来自Subramanian et al 2003 Red 与ssDNA结合形成丝状体 催化与互补ssDNA之间的退火 Red 抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解 2 RecE和RecT RecE C端39kDa的部分才是5 3 外切酶活性必需 对5 端为羟 基的底物也有活性 RecT 与ssDNA结合形成丝状体 催化与互补ssDNA之间的退火 3 RecA 个亚基形成有活性的RecA蛋白 细菌中广泛存在且高度保 守 有同源重组酶 DNA损伤修复 DNA依赖ATPase活性等功能 可诱导
8、SOS反应 挽救DNA复制叉等 提高电击后细胞的活 力 增加电转化效率 五 Red ET重组操作流程 引物设 计合成 线性供体dsDNA 底物的制备 线性载体的 制备 重组反应 重组产物转化 至感受态细胞 重组子 筛选 重组子检测 1 设计合成引物 设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则 但是上下 游引物要加上15 20bp的载体同源序列 载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况 1 载体酶切后是5 端突出或平末端 则引物上的同源序 列包括5 端突出序列的同源序列 2 载体酶切后是3 端突出 则引物上的同源序列不包括 3 端突出序列的同源序列 引物设计方法 同源臂长度对Red ET重组效率的影
9、响 数据来自Zhang et al 1998 同源臂的长度在15 50bp时 重组效率就能满足实验要求 重组效率随着同源臂长度的增加而增加 2 线性供体dsDNA底物的制备 u 选用保真度高的DNA聚合酶 如Phusion Pyrobest等 减少 PCR反应中的突变 扩增GC含量较高的DNA片段时 选用Triplemaster HotStarTaq 等 用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物 u 纯化PCR产物 1 减少模板背景对筛选工作带来的难度 2 降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合 提高重组效率 3 去处PCR产物中的盐离子 提高转化效率 u 降低模板对筛选工作带来的难度 1 纯化
10、回收PCR产物 2 内切酶消化处理模板 3 使用R6K复制子 线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得 1 酶切 选取合适的位点 单酶切或双酶切皆可 质粒的线性化不彻底 将导致阴性 克隆的产生 为了提高阳性率 建议通过双酶切进行质粒线性化 2 PCR扩增 选取合适的位点 设计正向和反向引物 引物长度一般在18 20bp左右 建 议用高保真的聚合酶扩增 为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响 建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物 降低背景 提高阳性率 不管采取哪种方法 最终线性化载体的浓度需 50ng ul 高浓度的载体有 利于提高效率 3 线性载体的制备 4 同源重组反应 试剂加量 1
11、0 x Buffer1ul Recombination Enzyme1ul 线性化载体 50ng ul 50 100ng 插入片段 50ng ul 150 200ng dd H2O补足至10ul 1 配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反 应 摩尔比可计算方法见附录 10 ul体系 见下表 注意 1 目的片段与载体的摩尔比在2 1 5 1之间 摩尔比低于2 1效 率会降低 2 反应时间在15 30分钟 时间太短不利于重组反应 2 短暂离心混匀 37 孵育15分钟 3 反应结束后 取5 10ul反应液立即进行转化 剩余反应液可在4 或 20 保存待用 5 重
12、组产物转化至感受态细胞 冰上融化一管100 l的DH5 感受态细胞 加入5 10 l反应液到感受态细胞中 轻轻混匀 冰上孵育 30分钟 42 水浴中热激45 90秒后 冰浴3分钟 注意 所使用的感受态细胞效率 1 108cfu g 加入890 l SOC液体培养基 37 复苏45 60分钟 6 重组子筛选 u 复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体 根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上 37 倒置培养12 16h 后观察菌落生长情况 u 使用抗生素的最低抑菌浓度 有利于获得更多的重组子 在10 g mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60 g mL的卡那霉素平板上 重组子的数目
13、的6倍 抗生素使用浓度与Red ET重组效率的关系 常用抗生素的工作浓度 7 重组子的检测 u 检测方法 酶切分析 PCR检测 平板双划线 测序等 一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定 为避免假阳性结果 鉴定引物选 择一条为载体特异性引物 另一条引物为目的片段特异性引物 u 高拷贝质粒修饰存在 质粒多聚体 现象 u 质粒多聚体 问题解决办法 采用 线性DNA 线性DNA 重组方式 利用RecE RecT重组酶系统 减低质粒拷贝数 卡那霉素抗性基因 Kan 替换pUC19中的氨苄抗性基因 Amp 质粒多聚体 现象 解决办法 u 采用 线性DNA 线性DNA 重组方式 u 利用RecE RecT重组
14、酶系统 u 减低质粒拷贝数 六 Red ET重组技术的主要应用 1 重组质粒的构建 2 染色体的修饰 3 亚克隆 Subcloning 4 直接克隆 Direct cloning 1 重组质粒的构建 1 传统基因克隆技术的缺点 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化 当缺 少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时 利用内切酶消化难以得到相应的产物 方法看似简单 但实验周期长 大片段难以与载体正确连接 无法同时连接多个 2个以上 的DNA片段 限制性内切酶 连接酶 步骤1 酶切目的片段 步骤2 酶切载体 步骤3 目的片段与载体连接 同源重组克隆步骤传统克隆步骤 步骤4 重组
15、子转化到感 受态细胞 同源重组克隆传统克隆 克隆片段 长度 50bp 10kb50bp 2kb 一次克隆 片段数 1 5个1个 感受态效 率要求 1 108cfu ug以上1 107cfu ug以上 所用的酶重组酶T4连接酶 片段的插 入位点 任何位点特定位点 片段酶切不需要需要 载体线性 化方法 酶切或PCR酶切 同源重组克隆与传统克隆比较 插入选择标记插入无选择标记的DNA片段 2 染色体的修饰 E coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术 A 和Red ET重组技术 B 修饰E coli染色体实验步骤比较 B 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小 3 亚克隆 Subcloning
16、 4 直接克隆 Direct cloning A 亚克隆和直接克隆示意图 Red ET subcloning 亚克隆 pGB 15A载体抗性基因簇 直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇 3 mg基因组DNA用EcoR V消化 Mx unknown PKS gene cluster 36kb p15A ori Cm PKS from other bacteria Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse 异源表达 七 Red ET重组新技术的发展 1 三重同源重组 Triple recombineering 三重同源重组示意图 cry1Ac的启动子片段和 终止子片段 一步 重组入 pHT315质粒上 2 四重同源重组 Quadruple recombineering 四重同源重组示意图 质粒pR6K GT1 cotc lacZneo上目的 片段 6123bp 插入人类 scn10a基因 BAC的第一个 内含子中 3 双同源臂 策略 Double homology arms strategy 双同源臂 策略示意
