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1、抗氧化活性研究方法 以酶标法清除DPPH自由基为主 1 目录 v 一 检测抗氧化活性的原因 v 二 自由基的产生及抗氧化的重要性 v 三 检测方法 v 四 DPPH法 原理 一般方法 酶标法 v 五 ABTS法 v 六 TBARS法 v 七 铁离子还原能力 FRAP 一 检测抗氧化活性的原因 1 天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性 2 抗氧化剂有延缓衰老等功效 越来越受到人们关注 3 据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性 4 抗氧化活性测试简单 快捷 经济 二 自由基的产生及抗氧化的重要性 抗氧化剂 自由基对人体造成的伤害 天然植物 三 检测方法 v 目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于
2、以下机理 v 1 在特定条件下 样品对检测体系中脂类物质的氧化抑 制能力反映被测物的抗氧化活性 TBARS法 v 2 在特定条件下 样品对检测体系中自由基的清除能力 反映被测物的抗氧化活性 DPPH自由基的清除 v 3 在特定条件下 测定样品的还原能力反映被测物的抗 氧化活性 还原Fe3 四 DPPH法 1 原理 DPPH 二苯代苦味酰基自由基 是一种以氮为中心的稳定 自由基 特点 醇溶液呈紫色 波长为517nm下具有最大吸收 具有单一电子 故能接受一个电子或氢离子 有自由基 清除剂存在时 DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅 在最大光吸收波长处的吸光值下降 吸光度水平的降低表 明抗氧化性的增
3、加 从而以评价试验样品的抗氧化能力 此抗氧化能力用抑制率来表示 抑制率越大 抗氧化 性越强 实验步骤 2 实验步骤 1 酶标法检测 酶标仪 v 取96孔细胞培养板 各孔分别加入150 mol L 1的DPPH 溶液180 L 各浓度梯度样品溶液20 L 终浓度分别为3 9 500 mol L 1 反应总体积200 L 以溶剂作对照 加 样后 振荡混匀 封板胶封板后 室温下避光静置 分别 在10 120min时间范围内于517nm处测定各孔吸光度值 观 察样品抗DPPH的时效量效变化过程 确定实验的稳定性和 最佳实验反应时间 v 计算公式为 清除率 A 溶剂 A 样品 A 溶剂 x100 Vit
4、E清除DPPH自由基抗氧化量效曲线 10 120min内 随着 作用时间的延长 VitE抗DPPH作用增 强 但在3 9 31 2 mol L 1范 围内 各时间点的 药效变化不明显 62 5 500 mol L 1 浓度范围 随着浓 度增加 各时间点 的药物作用曲线逐 渐分离 并在 500 mol L 1 各 时间点量效趋于平 稳 从图中可以看 出 在这些时间点 中 30min的量效曲 线基本呈斜线上升 30min VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲线 反应时间t为30min的量效曲线 相关系数 实验步骤 2 一般方法 紫外分光光度计法 将样品用甲醇配制成一系列浓度 取0 1mL样品加入
5、3 5 mL DPPH甲醇溶液 0 06 mmol L 混合30min后测定515 nm处吸光度 每份样品平行操作3次 计算公式为 清除率 A 溶剂 A 样品 A 溶剂 x100 酶标法优势 3 酶标法优势 抗氧化微孔板实验方法的优势 耗材量少 试剂量以微 升计 试剂种类少 部分试剂配制可交互使用 方法 简便 耗时短 可重复性强 可以广泛应用于药物筛选 特别是高通量药物筛选研究 五 ABTS法 1 原理 以水溶性的ABTS 自由基引发剂为显色剂 特点 ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝 绿色阳离子自 由基ABTS 最大吸光波长为734nm 向ABTS 其中加入被测物质 如果该物质中存在抗氧化成
6、分 则该物质会与ABTS 发生反应而使反应体系褪色 然后 在ABTS 这种自由基的734nm吸光波长下检测吸光度的变化 来反映物质的抗氧化能力 实验步骤 2 实验步骤 v 将样品用甲醇配制成一系列浓度 取0 15mL样品加入 2 85mLABTS自由基工作液 混合 放置10min后 在734nm 处测定吸光度 每份样品平行操作3次 v 计算公式为 清除率 A 溶剂 A 样品 A 溶剂 100 v A 溶剂 为2 85 mLABTS溶液与0 15mL甲醇混合后的吸度 A 样品 为2 85mLABTS溶液与0 15mL样品混合后的吸光度 ABTS法优缺点 3 优缺点 简便 快速 适合于大量样品的检
7、测 ABTS在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的一个不足 它可与任何羟基化的芳香族化合物反应 这与它们的实 际抗氧化能力关 因此 TEAC值也包括对抗氧化不起作用 的羟基 六 TBARS法 简介 脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧 化物的浓度 氧的去除或氧化产物的形成 因此 反应物 不饱和脂肪酸 自由基等 的消失 氧化产物的定量可能 是判断氧化阶段的最合适方法 通过直接或者间接检测氧 的消失和自由基的电子自旋光谱 适用于氧化过程的初始 阶段 通常采用TBARS法来评价脂质的过氧化 七 铁离子还原能力 FRAP 原理 FRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法 在酸性条件下 Fe3 一TPTA Fe3 三吡啶三嗪 被抗氧化剂还原成Fe2 一 TPTZF 溶液变成深蓝色 并且在593nm处有强吸收 FRAP 法具有快速 简便 重复性好等优点 该法不仅用于检测 食物及饮料的抗氧化活性 也可用于检测纯天然抗氧化剂 的活性 17 此课件下载可自行编辑修改 供参考 感谢您的支持 我们努力做得更好
