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1、临床输血与检验创新性实验设计二级学院：检验学院 教研室：临床检验学实验名称母婴Rh血型不合的新生儿溶血病检查的实验设计专业：医学检验层次：本科年级：2009小班：课题组主要成员姓名性别学号备注王千慧女10203070？林日娟女10203070229钟晓女10203070230陈远晓女10203070232卢雪如女10203070217卢宇东男10203070？周 杰男10203070？朱虹亮男10203070233周伟泽男10203070？新生儿溶血病是由于母婴血型不合，胎儿红细胞进入母体循环致使母体产生了相应的IgG类抗体。该抗体作用于胎儿红细胞而引起的同种被动免疫性疾病。HDN可引起婴儿贫
2、血、黄疸、水肿、肝脾肿大，严重者可导致胆红素脑病，引起新生儿死亡或智力发育障碍。因此，对HDN进行早期、准确的诊断有重要意义。新生儿溶血病的患儿血清学检测主要是“三项试验”，即：直接抗球蛋白试验(DAT)；血清游离抗体测定试验；新生儿红细胞抗体释放。但由于微柱凝胶技术利用分子筛效应和亲和效应，红细胞抗原与相应的抗体结合，经离心，便可检测血型、不完全抗体及作交叉配血试验，具有操作简单、结果准确、敏感且易于判读等优点，所以本实验设计主要采用微柱凝胶试验和直接、间接抗人球蛋白试验以及相关的辅助检查来对母婴Rh血型不合的新生儿溶血病作出诊断。 一、实验设计（一）标本、试剂及器材标本：静脉血试剂：微柱凝
3、胶试验【抗人球蛋白凝胶微柱卡：含有抗人球蛋白（抗IgG+C3），可用于检测IgG类不完全抗体（间接抗球蛋白试验），IgG类不完全抗体（或）补体致敏红细胞（直接抗球蛋白试验）】抗人球蛋白试验【5%筛检红细胞（试剂红细胞，用于间接抗人球蛋白试验）、抗球蛋白试剂盒（商品试剂，用于直接抗人球蛋白试验）、IgG包被的红细胞、生理盐水】器材：微柱凝胶试验【微量吸样枪、微柱凝胶检测卡专用离心机】抗人球蛋白试验【试管、记号笔、试管架、滴管、乳胶吸头、吸量管、洗耳球、载玻片、离心机、显微镜、滤纸】（二）主要实验 产前检查微柱凝胶试验 （1）检测血型1.将受检者红细胞（不用洗涤）配成1%生理盐水悬液，向已标记好的
4、特异性凝胶微柱卡的微管反应腔内加50L。2.立即与1000转每分钟，离心10分钟，观察结果3.观察及判断血型结果：阳性：对照管细胞沉淀在管底，检测管凝集块在胶上或胶中。阴性：对照管和检测管的细胞沉淀均在管底。实验失败：对照管细胞在胶上或胶中，重新试验。4.报告方式：Rh(D)血型阴性/阳性（2）筛检和鉴定不完全抗体1.取筛检红细胞或谱细胞悬液（1红细胞生理盐水悬液）各50L，分别加入标记好的微管反应腔中。2.然后分别立即加入受检血清25L。3.将已加好反应物的凝胶卡放入37度孵育15min。4.取出凝胶卡立即以1000r/min水平离心10min，观察结果。5.观察及判断血型结果：同血型检测。
5、6.报告方式：筛检试验 阳/阴性。间接抗人球蛋试验1.加血请：分离父亲或母亲（胎儿则取羊水血型物质），取两滴置于标记好的小试管中。2.滴加5%筛检红细胞1滴于小试管中，混匀。3.温育：37度温育30-60min。4.离心：1000r/min离心1min。 产后检查 微柱凝胶试验 （1）检测血型1.将受检者红细胞（不用洗涤）配成1%生理盐水悬液，向已标记好的特异性凝胶微柱卡的微管反应腔内加50L。2.立即与1000转每分钟，离心10分钟，观察结果3.观察及判断血型结果：阳性：对照管细胞沉淀在管底，检测管凝集块在胶上或胶中。阴性：对照管和检测管的细胞沉淀均在管底。实验失败：对照管细胞在胶上或胶中，
6、重新试验。4.报告方式：Rh(D)血型：（2）筛检和鉴定不完全抗体1.取筛检红细胞或谱细胞悬液（1红细胞生理盐水悬液）各50L，分别加入标记好的微管反应腔中。2.然后分别立即加入受检血清25L。3.将已加好反应物的凝胶卡放入37度孵育15min。4.取出凝胶卡立即以1000r/min水平离心10min，观察结果。5.观察及判断血型结果：同血型检测。6.报告方式：筛检试验 阳/阴性。间接抗人球蛋试验1.加血请：分离父亲或母亲血清（胎儿的则取羊水血型物质），取两滴置于标记好的小试管中2.滴加5%筛检红细胞1滴于小试管中，混匀。3.温育：37度温育30-60min。4.离心：以1000r/min离心
7、1min5.观察：观察是否有溶血和凝集，并记录结果产前检查微柱凝胶试验直接抗人球蛋试验1.洗涤红细胞：彻底悬浮细胞，用盐水洗涤5次。最后一次洗涤后，弃掉全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干。2.加抗球蛋白：按试剂说明加最适稀释度抗人球蛋白血清1滴，充分混合。3.离心：以1000r/min离心1min4.观察：轻轻悬浮细胞，观察是否有溶血或凝集，有溶血或凝集为阳性，否则为阴性。5.复核：阴性者应加IgG包被的红细胞1滴，离心并观察结果：凝集，表示阴性结果可靠。不凝集，表示试验无效，必须重做。（三）辅助实验 5.观察：是否有凝块和溶血，并记录结果。 产后检测可疑Rh 等其他血型系统血型不合应在出生后
8、尽早为好。微柱凝胶试验 （1）检测血型1.将父亲或母亲或婴儿红细胞（不用洗涤）配成1%生理盐水悬液，向已标记好的特异性凝胶微柱卡的微管反应腔内加50L。2.立即与1000转每分钟，离心10分钟，观察结果。3.观察及判断血型结果：阳性：对照管细胞沉淀在管底，检测管凝集块在胶上或胶中。阴性：对照管和检测管的细胞沉淀均在管底。实验失败：对照管细胞在胶上或胶中，重新试验。4.报告方式：Rh(D)血型阴性/阳性（2）筛检和鉴定不完全抗体1.取筛检红细胞或谱细胞悬液（1红细胞生理盐水悬液）各50L，分别加入标记好的微管反应腔中。2.然后分别立即加入受检血清25L。3.将已加好反应物的凝胶卡放入37度孵育1
9、5min。4.取出凝胶卡立即以1000r/min水平离心10min，观察结果。5.观察及判断血型结果：同血型检测。6.报告方式：筛检试验 阳/阴性。直接抗人球蛋试验1.洗涤红细胞：彻底悬浮细胞，用盐水洗涤5次。最后一次洗涤后，弃掉全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干。2.加抗球蛋白：按试剂说明加最适稀释度抗人球蛋白血清1滴，充分混匀。3.离心：1000r/min离心1min。4.观察：轻轻悬浮细胞，观察是否有溶血或凝集，有溶血为阳性，否则为阴性。5.复核：阴性者应加IgG包被的红细胞1滴，离心并观察结果：凝集：表示阴性结果可靠。不凝集：表示试验无效，必须重做。（三）辅助实验（母亲及刚出生疑有溶血
10、胎儿或婴儿）1.流式细胞仪检查血常规，包括血红蛋白、红细胞计数、网织红细胞计数、白细胞计数、血小板计数2.血涂片检查细胞形态：尤其要观察红细胞是否有溶血及凝块形成。3. 胆红素测定、羊水胆红素含量测定：胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素，特异性高，手工操作简便快捷，也适合自动化生化分析仪操作。（四）研究内容与方法的技术路线 （以线路图的形式简要展示）产前检查血型血清学检查常规检查产妇及其丈夫R h 血型D抗原鉴定产妇血清的不规则抗体筛选及筛选阳性者效价检测胎儿的血型物质，确定胎儿血型（微柱凝胶试验、间接抗人球蛋试验）外周血常规检查血红蛋白、血涂片检查、红细胞计数、网织红细胞计数、白细胞计数
11、、血小板计数胆红素测定、羊水胆红素含量测定判断：Rh血型阳性或阴性产后检查血型血清学检查常规检查产妇及其丈夫R h 血型D抗原鉴定产妇血清的不规则抗体筛选及筛选阳性者效价检测婴儿的血清，确定胎儿血型（微柱凝胶试验、直接抗人球蛋试验）外周血常规检查血红蛋白、血涂片检查、红细胞计数、网织红细胞计数、白细胞计数、血小板计数胆红素测定、羊水胆红素含量测定判断：Rh血型阳性或阴性二、 近五年参考文献（参照检验医学与临床杂志的投稿要求）1 兰炯采,刘景汉,马红丽,等.新生儿溶血病( HDN) 免疫血液学试验推荐方案J.中国输血杂志,2012,2(25):95-100.2 宋宁,陈静娴,李宏.新生儿溶血病检
12、测/兰炯采,贠中桥,陈静娴输血免疫血液学实验技术,北京:人民卫生出版社,2011:45-573 潘纪春.庄远.PAN Ji-chun.ZHUANG Yuan .新生儿溶血病血清学检查分析J.科学技术与工程2010,10(5)4 杨珊.新生儿溶血病血清学检测结果分析J.海南医学.2009.20(l)139-1415 卢磊,刘燕.微柱凝胶技术在新生儿溶血病检测中的应用J .中国现代医生.2010.48(13)6杨秀丽.红细胞直接抗球蛋白试验阳性Rh血型鉴定方法J.国际检验医学杂志. 2011,32(14):1609-1610.7 徐 玮. 新生儿溶血病免疫血液学检测进展J. 吉林医学.2013,
13、34(12): 2339-2340. 三、 设计创新及存在问题传统的试管法抗球蛋白检查方法在手工操作中受到血清与红细胞比例、离心速度和时间等因素的干扰，操作过程中需反复洗涤红细胞。结果判断人为影响因素较多，重复性较差；而且在洗涤过程中由于抗原和抗体之间的亲和力较弱，抗体易被洗脱掉，易出现假阴性。微柱凝胶技术是建立在传统血型血清学基础上的一项免疫学检测技术，是通过调节凝胶的浓度来控制凝胶间隙的大小，利用离心力将抗原和抗体反应后的凝集红细胞留在微柱上端或分布在凝胶中，未凝集红细胞通过间隙到达微柱底部。同时不用洗涤红细胞可使抗人球蛋白被残留蛋白质中和，抗人球蛋白被洗涤后残留的盐分稀释所产生的假阴性不再发生。因此，微柱凝胶法与传统试管法相比，具有操作简便、敏感、易于标准化、影响因素少、重复性好、结果可保存等优点，适用于大批量标本的检测。四、评审成绩 2013 年 月 日
