医学遗传学设计实验 ppt课件

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1、医学遗传学设计实验 实验设计方案 6 参考文献 一 实验名称 二 总体设计思路 三 具体设计方案 1 实验目的 2 实验原理 3 实验材料 试剂及器材 4 实验方法及注意事项 5 实验预期结果及遗传指导 一 实验名称 从孕妇外周血中提取胎儿 DNA进行a地贫的产前诊断 二 总体设计思路 抽取孕妇外周血 提取胎儿DNA 利用 PCR技术进行胎儿DNA扩增 利用Sou thern分 子印迹杂交法检测出限制性片段长 度多态性 RFLP 进行基因诊断 用DNA限制酶处 理扩增产物 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针标记 预杂交 Southern杂交 洗膜 放射性自显 影检测 三 具体设计方案 1 实验目的 v

2、利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行a地贫的产 前诊断 从而进行遗传指导 2 实验原理 v地中海贫血的分布遍及全世界 我国南方省区的发 病率也较高 如广西壮族自治区可高达14 6 其 次为广东 海南 云南等 在遗传咨询的基础上 对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是 防止遗传病 先天畸形患儿出生的最有效而可行的 方法 对于减少群体中致病基因频率和提高人口素 质具有十分重要的意义 v传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺 绒毛膜取 样和脐静脉穿刺等 它们都具有创伤性 可能对孕 妇及胎儿造成一定危害 如宫内感染 出血甚至流 产 死胎等 利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进 行产前诊断是一项非创伤性

3、产前诊断技术 易于被 孕妇接受 v孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对高 提取及 分析过程简单 易于发展为可应用于临床的大样本 高通量的检测方法 另外胎儿DNA在孕早期就可检 测到 且分娩后很快被清除 不会受前次妊娠的影 响 vPCR技术能在体外快速简便地扩增特异的DNA片段 为基因诊断分析提供了方便 被广泛运用于遗传 病和肿瘤的基因诊断 若PCR产物的片段中包含有 RFLP的切点 则可将PCR扩增产物用相应的限制 酶处理 经电泳后检测其多态性 结合系谱进行分 析 可进行基因诊断 vSouthern分子印迹杂交是将酶解后的DNA片段经 琼脂糖凝胶电泳分离 然后经碱变性 Tris缓冲液 中和 高

4、盐下通过吸附作用将DNA从凝胶中转印至 硝酸纤维素滤膜上 附着在滤膜上的DNA与32p标 记的探针杂交 利用放射自显影技术确定探针互补 的每条DNA带的位置 从而可以确定在众多酶解产 物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小 此 法可检测出限制性片段长度多态性 RFLP 从 而进行基因诊断 3 实验材料 试剂及器材 v3 1 材料 孕妇的新鲜外周血5 ml 琼脂糖凝 胶 新制备 硝酸纤维素滤膜 NC膜 透明胶带 防护眼镜 塑料瓶 塑料袋 保鲜膜 滤纸 X光底片 v3 2 试剂 EDTA 乙二胺四乙酸 盐抗凝剂 0 12 ml 10 的中性buffer溶液 含4 的甲醛 QIAamp DNA提

5、 取试剂盒 Qiagen Taq酶 Takara 双蒸水 PCR缓冲液 dNTP Promega AmpF1STR扩 增试剂盒 ABI BamHI内切酶 DNA上样缓冲液 放射性物质 32p 变性液 预杂交液 2 SSC 50 甲酰胺 X光片冲洗液 v3 3 主要仪器 离心机 冰箱 基因扩增仪 微量移液枪 20 l 电泳仪 紫外透射仪 封口器 southern印迹杂交 实验仪器 水浴锅 0 42 100 琼脂糖 平板电泳装置 放射性检测仪 暗盒 加双侧增感 屏 4 实验方法及注意事项 4 1 方法步骤 v4 1 1 血浆制备 抽取孕妇外周血5 ml 加入EDTA抗凝剂 0 12 ml 10 的

6、中性buffer溶液 含4 的甲醛 进行预处 理 v4 1 2 提取胎儿游离DNA v 1 离心 第一次离心 经预处理后的血浆以1600 g的速度 离心10min 离心后取上清液置一20 保存备用 第二次离心 将第一次离心后的上清液以13000 16000 g的速度高速离心10min 离心后取上清液 置一20 保存备用 v 2 提取胎儿游离DNA 取出上清液按照血样DNA提取试剂盒 QIAamp DNAbloodmini Qia2gen 说明书中血液DNA的提 取方案提取DNA v4 1 3 利用PCR技术进行胎儿DNA扩增 采用15 bp的随机引物 反应体系为 l0 PCR缓冲 液5 l T

7、aq酶5 U 25 mmol L MgC12 5 l 2 5 mmol L dNTP 4 l 200 mmol L 15 bp随 机引物5 l 加双蒸水至50 l 置于基因扩增仪 上 反应条件为94 预变性4 min 后 开始循环 94 1 min 37 2 min 55 4 min 循环30次 最后72 延伸5 min 4 保存 v4 1 4利用Southern分子印迹杂交法检测出限制性 片段长度多态性 RFLP 进行基因诊断 v 1 用BamHI内切酶酶处理扩增产物 反应体系如 下 待酶切DNA 1 g 双蒸水 适量 10X Buffer BamHI 2 l BamHI 0 5 1 l 总

8、体积 20 l 37 孵育1小时或更长时间 结果可能获得10kb 14kb两种长度的含a珠蛋白基 因簇的DNA片段 v2 琼脂糖凝胶电泳 1 加样 取18 l胎儿DNA酶处理液与2 l的DNA上 样缓冲液混匀 用微量移液枪小心加入样品槽中 2 电泳 加完样后 插上导线 打开电源 按 照 需 要 调 节 电压至120V 电泳开始 观察电泳槽中 负极的铂金丝处是否有气泡出现 3 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时 将 电压回零 关闭电源 停止电泳 4 取出凝胶 在波长为302nm的紫外灯下观察染 色后的电泳胶板 DNA存在处显示出肉眼可辨的桔 红色荧光条带 v3 转膜 将凝胶中的单链DNA片段

9、转移到硝酸纤维素滤膜 上 v4 探针标记 将纯化的DNA片段用放射性物质 32p 标记 5 预杂交 prehybridizafion 1 把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中 在水浴中预 热至杂交温度 42 2 将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一 个稍宽于滤膜的塑料袋 用5 10ml2 SSC浸湿滤膜 3 将胎儿DNA置沸水浴中10min 迅速置冰上冷 却1 2min 使DNA变性 4 从塑料袋中除净2 SSC 加入预杂交液 按每 平方滤膜加0 2ml 5 加入变性的胎儿DNA至终浓度200 g ml 6 尽可能除净袋中的空气 用热封口器封住袋口 上下颠倒数次以使其混匀 置于42 水浴中温育

10、4h v6 Southern杂交 1 将标记的DNA探针置沸水浴10min 迅速置冰 上冷却1 2min 使DNA变性 2 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料 袋 剪开一角 将变性的DNA探针加到预杂交液中 3 尽可能除去袋中的空气 封住袋口 滞留在袋 中的气泡要尽可能地少 为避免同位素污染水浴 将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内 4 置42 水浴温育过夜 至少18h v7 洗膜 取出NC膜 在2XSSC溶液中漂洗5min 然后按下 列条件洗膜 2 SSC 42 10min 1 SCC 42 10min 0 5 SCC 42 10min 0 2 SSC 56 10min 0 1 SS

11、C 56 10min 边洗边用放射性检测仪检测放射强度 当 放射强度指示数值较环境背景高1 2倍时 即停止洗 膜 洗完的膜浸入2 SSC中2min 取出膜 用滤纸 吸干膜表面的水分 并用保鲜膜包裹 v8 放射性自显影检测 1 将滤膜正面向上 放入暗盒中 加双侧增感 屏 2 在暗室内 将2张X光底片放入曝光暗盒 并用 透明胶带固定 合上暗盒 将暗盒置 70 低温冰箱 中使滤膜对X光底片曝光 根据信号强弱决定曝光 时间 一般在1 3天 3 从冰箱中取出暗盒 置室温1 2h 使其温度上 升至室温 然后冲洗X光底片 洗片时先洗一张 若感光偏弱 则在多加两天曝光时间 再洗第二张 片子 4 2 注意事项

12、v1 胎儿游离DNA提取时应尽量减少血样放置时间 以减少细胞坏死和溶解 提高胎儿游离DNA的检 出率 v2 PCR扩增时 其最关键的是引物的设计 长 度为15 30核苷酸 GC含量50 TM值处于 56 62 之间 3 末端必须严格与模板DNA 配对 其构成DNA延伸的起始点 v3 PCR扩增时 反应的退火温度应慎重选择 温 度高可提高特异性 但敏感性降低 温度低则反之 v4 印迹时 两块玻璃板之间灌的胶一定要早并且 要防止胶漏 v5 应确保每孔上样量一致 不致使带跑得比窄 v6 倒胶的时候 用1ml的枪沿一侧缓缓加 不要打 到头 以免带入气泡 v7 转膜过程中注意降温 要防止微量进样器被 堵

13、 v8 内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上 使用 完毕后宜立即放置于 20 保存 v9 把Buffer和水等充分混匀后再加入内切酶 加入 内切酶后可以用枪吹打或轻轻Vortex混匀 v10 加样时小心操作 避免损坏凝胶或将样品槽底 部凝胶刺穿 v11 紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面 罩 以免损伤眼睛 v12 因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针 DNA 因此 在进行杂交前 必须将膜上所有能与 DNA结合的位点全部封闭 v13 转膜必需充分 要保证DNA已转到膜上 v14 若用到有毒物质 必需注意环保及安全 v15 在洗膜过程中 要不断振荡 不断用放射性检 测仪探测膜上的放射强度

14、洗膜不充分会导致背景 太深 洗膜过度又可能导致假阴性 v16 保鲜膜与硝酸纤维素滤膜之间不能有气泡 5 实验预期结果及遗传指导 v预期结果 1 2 3 4 10kb 14kb v 1 出现结果1 aa aa 正常 建议生育 v 2 出现结果2 aa a 静止型a地中海贫血 患 者无任何临床症状和异常血象 仅在出生时的脐血 中检出1 5 的Hb Bart s 视情况建议生育 v 3 出现结果3 aa 轻型a地中海贫血 临 床上无明显的临床症状 个别人表现为轻度低色素 小细胞性贫血 出生时有5 15 的Hb Bart s 红细胞有轻度形态和渗透性改变 可查到少量的 HbH包涵体 建议不生育 v 5

15、 出现结果4 a HbH病 建议不生育 v6 参考文献 v 1 王文博 张 毅 孙树汉 孕妇外周血中胎儿游离 DNA在产前诊断中的应用 第二军医大学学报 2009年4月第30卷第4期 v 2 王修海 姜晓静 纪向虹 孕妇血浆胎儿DNA检 测及其在产前诊断中的应用 青岛大学医学院学报 2019年2月第43卷第1期 v 3 龙兴江 龙桂芳 林伟雄 利用孕妇外周血浆中 小片段游离胎儿DNA进行a 地中海贫血无创性产前 诊断 中国优生与遗传杂志 2019年第16卷第10期 v 4 罗娟 周国华 利用孕妇血浆中胎儿DNA进行 无创性产前诊断的研究进展 药学与临床研究杂志 2019年第15卷第4期 v 5 刘敬忠 王立荣 黄莉嘉 肖白 周艳 a地中 海贫血的基因诊断及产前诊断研究 中华血液学杂 志 2019年2月第26卷第2期 v 6 李芳秋 郝秀芳 吴元赭 检测孕妇血循环中胎 儿DNA进行无创产前诊断的研究进展 中华妇产科 杂志 2019年3月第39卷第3期 v 7 税青林主编 案例版 医学遗传学 科学出版 社2019年1月第二版 谢谢观看