《以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1以 STO 细胞和 hELF 作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较作者：刘永刚，李芳菲，陈地龙，王莎莉，王亚平【关键词】 STO 细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类Comparison between STO cells and hELF used as feeder layers of embryonic germ cells【Abstract】 AIM: To compare the influence on the growth of human embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived thioguanine and
2、 ouabain resistant (STO) cells and human embryonic lung fibroblasts（hELF）respectively as feeder layers and the changes of the two kinds of the feeder layers themselves processed with mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured hELF of 3-4 month embryos. The changes of the two kinds of the feeder
3、layers themselves treated with mitomycin C were observed. STO and hELFs erved as feeder layer to cultivate human EG cells.The formation rate of embryonic germ cell colony and the expression of EG cell surface markers(SSEA1, SSEA4) 2expression were detected. to discuss the influence on human EG cell
4、growth. RESULTS: HELF treated by mitomycin C survived longer than STO cells treated by mitomycin C did. There was no obvious difference between the two kinds of feeder layers in the formation rate and immunologic markers (SSEA1, SSEA4) of EG cell colony. CONCLUSION: HELF as feeder layers is better t
5、han STO cells in culturing EG cells.【Keywords】 STO cells; embryonic lung fibroblasts; embryonic germ cells; humans【摘要】 目的： 比较以 STO 细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素 C 处理后的两种饲养层的变化. 方法： 分离、培养 34 mo hELF，观察经丝裂酶素 C 处理 STO 细胞和 hELF 后形态学变化，以STO 细胞和 hELF 作为饲养层培养人 EG 细胞，计数 EG 细胞集落的形成率以及免疫组化检
6、测 EG 细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原 1(SSEA1)和抗阶段特异性胚胎抗原 4(SSEA4). 结果： 经丝裂霉素 C 处理后 hELF 较 STO 细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF 和 STO 细胞作为饲养层培养人 EG 细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异. 结论： 在培养人 EG 细胞时，hELF 饲养层较 STO 细胞饲养层更有优势.3【关键词】 STO 细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类0 引言自 1998 年 Thomason 等1 首次建立人胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)系和 Sham
7、blott 等2建立人胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG)系以来，胚胎性干细胞研究已成为当今生命科学领域内的热门课题. 胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞，将为细胞、组织甚至器官替代治疗提供无限细胞来源，也将为临床治疗模式带来革命性变革3 . 谢松涛等4也对人胚胎生殖嵴来源的人 EG 细胞进行了培养，但迄今为止，来源于人胚胎生殖嵴的 EG 细胞系仅有一例报道. 有学者认为 STO 细胞在建立人 EG 细胞系过程中具有不可替代的作用. 由于 STO 细胞是来源于鼠的成纤维细胞系，用 STO 细胞作为饲养层将会给临床应用带来潜在的危险. 我们用 STO 细胞和人胚胎肺成纤
8、维细胞（human embryonic lung fibroblast, hELF）作为饲养层培养人 EG 细胞，旨在探讨两种饲养层经丝裂酶素 C 处理后的变化和对 EG 细胞生长的影响.1 材料和方法41.1 材料高糖 DMEM 培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）购自 GIBICO 公司； 无钙镁磷酸缓冲液 (Dulbeccos phosphate buffered saline, DPBS)、非必需氨基酸、二甲基亚砜、优质胎牛血清购自 Hyclone 公司；胰蛋白酶、 巯基乙醇、毛喉素（Forskolin）购自 Sigma 公司；丝裂霉素
9、 C 购自Kyowa Hakko Kogyo 公司；胶原酶购自上海桥源生物制药公司； DNA 酶购自 Roche 公司； 人重组碱性成纤维细胞生长因子 (human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF) 购自 Pepro Tech EC 公司；人重组白血病抑制因子(human recombinant leukemia inhibitory factor, hrLIF)购自CHEMICON 公司；抗阶段特异性胚胎抗原 1(SSEA1)mAb 和抗阶段特异性胚胎抗原 4(SSEA4)mAb 由美国芝加哥大学 Dr. Bruce La
10、hn 提供；UltrasenstinveTM SP 试剂盒购自迈新公司； DAB 显色试剂盒购自中山公司；611 wk 人工流产胚胎（重庆医科大学第二临床学院人流室同意提供）用于分离人 EG 细胞；34 mo 胚胎用于制备 hELF；STO 细胞由本室保存.1.2 方法1.2.1hELF 分离、培养及铺板无菌条件下取 34 mo 人工流产胚胎肺组织，按照薛庆善等的方法分离获取 hELF，常规方法培养5传代，经反复传代获得纯化的 hELF. 取对数生长期 hELF，用终浓度为 12.5 g/mL 丝裂霉素 C 处理 2.53 h；DPBS 洗 3 次； 2.5 g/L 胰酶消化 2 min；DP
11、BS 洗 3 次；以细胞浓度为 2105/mL 种植在 1 g/L 明胶处理后的 24 孔培养板中，每孔 1 mL；置 37 ，95%湿度和 50 mL/L CO2 恒温细胞培养箱中培养，4 h 后吸去培养液和尚未贴壁的细胞，换入等量培养液，置培养箱中备用，1 wk 内均可使用.1.2.2STO 细胞铺板取对数生长期 STO 细胞，用终浓度为 10 g/mL 丝裂霉素 C 按上述方法处理备用 .1.2.3 人胚胎生殖嵴细胞的分离和培养无菌条件下取得的611 wk 胚胎生殖嵴用 DPBS 冲洗 3 次；400 U/mL 的胶原酶 0.5 mL, 37下消化 45 min；灭菌加样枪反复吹吸，将生
12、殖嵴离散为小细胞团；1 g/L 的胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA 溶液，37 下消化 5 min；加入等体积含 100 mL/L 胎牛血清的培养液终止反应；加入200 U 的 Dnase作用 10 min；轻柔吹打使细胞分离，胚胎干细胞培养液重悬后以 1105, 110, 1103/mL 三种浓度种植于 STO细胞和 hELF 细胞饲养层，胚胎干细胞培养液包含 800 mL/L 高糖DMEM, 200 mL/L 胎牛血清,2 mmol/L L 谷胺酰氨,0.1 mmol/L 非必需氨基酸,0.1 mmol/L 2 巯基乙醇,10 mol/L Forskolin, 2 g/mL hrbFG
13、F, LIF 10105 IU/L, 10104 IU/L 青霉素和610104 IU/L 链霉素. 置 50 mL/L CO2, 95%湿度,37恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基.1.2.4 形态学观察用胚胎干细胞生长培养液培养经丝裂霉素C 处理后的 STO 细胞饲养层和 hELF 饲养层 14 d，在倒置相差显微镜下观察两种饲养层细胞的形态变化. 倒置相差显微镜下观察在STO 细胞饲养层和 hELF 饲养层上人 EG 细胞集落形态.1.2.5 在 STO 细胞和 hELF 饲养层上 EG 细胞集落形成率用胚胎干细胞生长培养液将消化后的人胚胎生殖嵴细胞稀释成 1105, 1104, 11
14、03/mL 的细胞悬液，分别种植于 STO 细胞和 hELF 饲养层上，每种细胞浓度种植 4 个复孔. 置于 37, 50 mL/L CO2 饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 计算集落形成率，即 4 个复孔形成集落总数与种植细胞总数之比.1.2.6 免疫细胞化学检测取两种饲养层细胞上形成的集落，40 g/L 多聚甲醛固定 1520 min；经 PBS 洗 3 次；按免疫组化SABC 法检测细胞表面抗原 SSEA1 和 SSEA4（一抗工作浓度为150）. 设不加一抗组为阴性对照组.统计学处理： 数据以 xs 表示，采用 SPSS12.0 进行方差分7析 F 检验. 显著性水平 =
15、0.05, P0.05 为有显著性差异.2 结果2.1hELF 体外生长与传代原代培养时所得细胞，细胞形状多种多样. 传代细胞至第 35 代时细胞形态基本一致，以长梭形成纤维样细胞为主，细胞排列成为放射状、漩涡状或栅栏状（图 1A）. 将其反复传至第 45 代，在第 530 代时生长最旺盛，平均 34 d达到汇合；第 3145 代时平均 56 d 达到汇合，形态无显著变化.2.2 丝裂霉素 C 处理后 STO 细胞和 hELF 形态变化用人 ES生长培养液培养 STO 细胞和 hELF 饲养层，培养 48 h 观察，STO细胞的培养液变黄，而人 hELF 的培养液颜色没有明显改变. 不更换培养
16、液，培养 72 h 后，少部分 STO 细胞浮起，细胞内可见颗粒状物形成；培养超过 6 d，大部分细胞浮起. 每 3 d 更换一次培养液，STO 细胞培养 5 d 后有部分细胞浮起，细胞内出现颗粒状物（图 1B）. 而人 hELF，培养 7 d 未见细胞浮起，细胞形态未见明显改变，并可维持 14 d（图 1C）.2.3 两种饲养层细胞对胚胎生殖细胞集落形成的影响人胚胎生殖嵴细胞以 1105，1104，1103/mL 三种浓度种植于 STO细胞和 hELF 饲养层上，培养 7 d 后观察计数. 结果显示：以1104/mL 组，集落形成最多，集落形态典型 (图 2A，B);81103/mL 组，集落形成数量最少；1105/mL 组，可见较多集落分化，集落细胞质中有颗粒样物出现,饲养层细胞和胚胎生殖细胞容易卷折. 以相同浓度种植胚胎生殖嵴细胞，两种饲养层细胞对人 EG细胞集落形成率没有显著性差异.A: 丝裂
