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1、WB实验技术及常见问题 分析 1 Western blot 定义 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 l 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到 杂交膜上 l 分离的蛋白可以通过一抗 二抗复合物进行检测 l 是蛋白质分析的最流行的技术之一 2 Western Blot操作流程 l 蛋白样品的制备 蛋白抽提 定量 l SDS 聚丙烯酰 胺 凝胶电泳 SDS PAGE凝胶制备 上样 l转膜 l封闭 l一抗杂交 l二抗杂交 l底物显色 3 水溶液提取法 针对 水 稀盐 稀酸或碱溶液中的蛋白质 稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳 定性好 溶解度大 是提取蛋白质最常用的溶剂 细胞裂
2、解液 50 mmol L Tris HCl 150 mmol L Nacl 5 mmol L EDTA 1 NP40 0 05 PMSF 2 g mL Aprotinin 0 5 g mL Leupeptin pH8 0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较 多的蛋白质可用有机溶剂提取 包括乙醇 丙酮和丁醇等 一 蛋白样品的制备 4 二 蛋白样品的定量 Bradford法 原理 考马斯亮蓝G 250有红 蓝两种不同颜色的形式 在一定浓度的乙醇和酸 性条件下 可配成淡红色的溶液 与蛋白结合后形成蓝色化合物 该化合物在 595nm处有最大吸收值 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 l 制作标准
3、曲线 插入表格 l 检测样 品蛋白含量 取一管考马斯亮蓝 95 l 0 15mol L NaCl NaCl溶液 5 l待测蛋白样品 混匀后静置2min 倒入比 色杯中测试 5 l 20 30 ug 细胞 组织 裂解物 100 ng 纯化蛋白 l 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 l 上样量一致 每孔上样量保持一致 l 上样前用loading buffer加热变 性样本 三 SDS 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳 6 Anode 内槽缓冲液带有负电 荷 与凝 胶顶部接触 外槽中缓冲液带有正电荷 与凝 胶底部接触 Cathode 带有负电 荷的蛋白质从上到下 运动 负极到正极 分开 电泳进程可以根
4、据前沿指示 剂来确定 等其跑到底部上 面1cm左右即可停止电泳 小分子量蛋白跑的比较较快 蛋白根据分子量大小分开 蛋白质带质带 有负电负电 荷 因此电电泳时时可以从负负极向正极移动动 标本加入到上样 孔中 7 8 四 Western Blot 转膜 分离的蛋白通过电转过电转 膜方式从凝胶中转转移到杂杂交膜上 PVDF或NC膜 nPVDF膜 价格较贵 可重复使用 特别适合蛋 白印迹 结合能力较强 但价格比较昂贵 nNC膜 硝酸纤维素膜 价格比较便宜 应用 较广 结合牢固性差一些 韧性也不如PVDF 不 能重复使用 但蛋白吸附容量高 亲水性较好 9 五 封五 封闭闭闭闭 l l脱脂奶粉 含脱脂奶粉
5、 含5 5 脱脂奶粉的脱脂奶粉的TBSTTBST缓缓冲液冲液 l lBSABSA l lWestern BlotWestern Blot 膜封膜封闭闭液 生物液 生物试剂试剂 公司提供 公司提供 10 六 一抗 二抗孵育 l 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中 加入一抗溶液 与滤膜温育 室温小时或4 过夜 l 倒掉一抗溶液 用PBS漂洗滤膜3次 每次10min l 加入配制的二抗 摇床上缓慢摇动 室温一小时或 4 过夜 l 倒掉二抗溶液 用PBS漂洗滤膜3次 每次10min 11 七 二抗与底物反七 二抗与底物反应显应显应显应显 色色 uECL化学发光显色 比较常用 结果容易控制 但是被催化是
6、 灵敏度差一点 uDAB显色 比较灵敏 是HRP最敏感的底物 12 Western Blot 需要的主要试剂 13 WB需要试剂 膜 常用的有PVDF膜 硝酸纤维 素膜或者尼龙 膜 14 WB需要试剂 封闭试剂 lBSA或者脱脂奶粉 光明脱脂奶粉 l商业化的封闭试剂 15 主要目的是确定靶蛋白的分子量大小 使用预染的 Marker还可以实时检测电 泳分离情况 并可以转移到 膜上 WB需要试剂 蛋白质Marker Prestained protein ladders Unstained protein ladders Fermentas 16 WB需要试剂 一抗 选择适合检测标 本种属的一抗 说
7、明书有验证 选择适用于WB实验方法的一抗 说明书有验证 选择单 克隆抗体或者经过亲 和纯化的多克隆抗体 根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例 Santa cruz Cell signaling Invitrogen Sigma Abcam R D Abnova Chemicon Calbiochem Millipore BD Cayman Roche eBioscience et al 选择选择 合适的一抗 17 杂交需要试剂 二抗 二抗选择选择 根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适 的二抗 二抗的使用 l 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗 l 如果说明书没有推荐浓度 可进行多个稀释
8、比例进行摸 索最佳稀释度 1 1000 1 20000 l 孵育条件一般为室温1 2小时 Santa cruz Cell signaling Invitrogen Sigma Abcam R D Abnova Chemicon Calbiochem Millipore BD Cayman Roche eBioscience et al 18 杂交需要试剂 底物 显色底物 操作简单 灵敏度低 如TMB DAB BCIP NBT 化学发光底物 灵敏度高 需要曝光检测设 备 暗室 曝光设备和胶片 或者凝胶成像设 备 19 WB常见问题 l 没有信号 l 高背景 l 非特异性条带 l 条带大小不对 2
9、0 标本问题 l 标本中不含检测蛋白 设置阳性对照 l 上样量不够 或者蛋白表达丰度比较低 增加上样量 转膜问题 l 转膜不完全 转膜后使用丽春红染色 确定目的大小蛋白条带是否存在于膜 上 使用蛋白质Marker l 洗涤过度 减少洗涤时间 和次数 封闭 l 封闭过度 减少封闭试剂浓 度 封闭时间 更换封闭试剂 抗体孵育和检测 l 抗体浓度和时间孵育不够 增加抗体浓度 延长孵育时间 l 一抗不工作 设置阳性对照 l 二抗不工作 和其他一抗配合检测二抗是否工作 l 一抗 二抗不匹配 检查抗体的来源和亚型 正确选择二抗 l 底物失活 重新配制有效的底物 没有信号 弱信号 21 背景高 封闭 l 封
10、闭时间 不够 延长封闭时间 l 优化封闭试剂 的类型和浓度 l 封闭试剂 和抗体有交叉反应 更换封闭试剂 l 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂 推荐BSA封闭 抗体孵育和检测 l 一抗 二抗浓度太高 降低抗体浓度 l 孵育温度太高 建议4度孵育过夜 其他 l 洗膜不充分 5 3mins 多次短时间的洗膜 l 曝光时间过长 缩短曝光时间 l 出现干膜现象 保证膜充分浸透 避免出现干膜 l 二抗非特异性 设置只加二抗对照 22 非特异性条带带 标本制备 l 二聚体或者多聚体 增加上样前煮沸变性时间 l 蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在 l 蛋白降解 使用新鲜制备的标本 标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂 l 上样量过大 减少上样量 封闭Blocking l 封闭不充分 优化封闭时间 和封闭试剂浓 度 抗体孵育和检测 l 一抗 二抗浓度过高 降低抗体浓度 l 抗体没有经过纯 化 l 二抗非特异性结合 使用二抗对照 其他 l 洗膜保证充分 23 条带带大小不对对 标本制备 l 二聚体 多聚体存在 使用还原变性电泳 除非说明书上有特殊说明 l 多个亚型存在 Isoforms l 蛋白降解 l 蛋白修饰 24 25 此课件下载可自行编辑修改 供参考 感谢您的支持 我们努力做得更好
