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1、1介导 MDR1 的 RNAi 腺病毒载体的构建【摘要 】 目的 介导 MDR1 的 RNAi 腺病毒载体, 探讨 RNA 干扰 MDR1 基因对人肝癌细胞的作用。方法 根据 MDR1mRNA 序列构建表达 MDR1mRNA 特异的 shRNA 的腺病毒穿梭质粒pshuttle MDR1。与腺病毒载体体内重组为 pAd MDR1 后转染人肝癌细胞 SMMC 7721, 以 FCM 检测细胞表面膜蛋白 Pgp 表达阳性率, 以共聚焦显微镜检测细胞内 Rh123 的潴留,Western Blot 检测 Pgp 蛋白量的变化。结果 构建成 pshuttleMDR1 经限制性酶切和 PCR 证实与设计
2、一致, 将 pAdMDR1 转染肝癌细胞SMMC7721 后, FCM 检测细胞表面膜蛋白 Pgp 表达阳性率为22.9%和 30.8%,远低于对照组(85.8%)。Western Blot 经病毒感染的 SMMC7721/R 的 Pgp 含量明显低于对照SMMC7721/R，而与 SMMC7721/S 细胞接近。结论 成功构建了 pshuttle MDR1 腺病毒载体, 并有效干扰了肝癌细胞细SMMC7721 MDR1 的表达。 【关键词】 RNAi 肝癌细胞 多药耐药基因 腺病毒载体0 引 言2化疗仍是肝癌综合治疗的重要手段之一，但是肿瘤的多药耐药性成为化疗的障碍。其中 MDR1 基因及其
3、产物的过度表达是多耐药的重要机制之一1 。我们应用 RNAi 技术可在细胞水平明显抑制肝癌细胞 SMMC7721 和 Bel7402 的 MDR1 的表达2 ，3 。为了进一步提高对细胞的转染效率以及为后期的动物实验做准备。我们设计构建了介导对于 MDR1 的 RNAi 的腺病毒载体，并进行了功能实验来验证设计思路的正确和载体构建的成功。1 材料与方法1.1 质粒 质粒 PGE1、腺病毒载体 pAdeasy1 及穿梭质粒pshuttle 均购自 Stratagene 公司。将针对 MDR1 的三段 siRNA 序列重组到 PGE1 质粒构建的 shRNA 质粒pshMDR11、pshMDR12
4、、 pshMDR13 均由本室设计并完成2，3 。将 pshMDR1 和 pshuttle 分别做 XhoI 和 XbaI 双酶切并纯化，重组构建成 pshuttle MDR1。12 细菌培养转化及重组质粒的筛选 大肠杆菌 SCS1、gold10 及 BJ5183 均购自 Stratagene 公司。常规氯化钙法转化细菌。pAdeasy1 质粒由含氨苄青霉素 LB 培养基筛选，其他均由含卡那霉素 LB 培养基筛选。313 PCR 引物设计：选择 Pshuttle MCS 两侧设计 PCR 引物用作重组质粒的筛选，引物序列为: 5 CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA
5、G3 和 5GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG3 由上海生工合成。 PCR 反应条件： 94 3min；94 30s，55 30s，72 1min。琼脂糖凝胶电泳，未重组 Pshuttle 质粒为 160bp 左右产物，而重组质粒在 600bp 左右。14 腺病毒载体的构建操作基本照公司操作手册进行，大致如下：重组质粒 pshuttle MDR1 经 PmeI 限制性酶切，与腺病毒质粒 padeasy 共转化 BJ5183 菌株, 鉴定后的阳性克隆经扩增、PacI 酶切后,在 AD293 细胞中包装完整病毒颗粒。15 细胞培养与转染 人耐药肝癌细胞株
6、SMMC7721/R（耐ADM 浓度 0.2mol/L）由本室诱导4，常规培养于含 10%小牛血清，青、链霉素各 100U/ml RPMI 1640 培养基中。LyoVecTM 转染试剂为美国 InvivoGen 公司脂质体产品，按说明书要求进行转染。转染空载体和无关序列载体作阴性对照，以表达荧光素酶基因的载体及 shluc 基因的表达质粒作为阳性对照组。1.6 细胞表面膜蛋白 Pgp 表达检测 各组细胞经消化并调整细胞数为 1106/ml, 2%甲醛固定,加入抗 Pgp 抗体（NeoMarkers 公司产品） ，4孵育 2h；加 FITC标记的羊抗鼠 IgG FITC标记的4羊抗鼠 IgG（
7、美国 KPL 产品）, 室温避光孵育 30min，流式细胞仪(Beckman coulter: EPICX XL)检测细胞表面 Pgp 阳性率。试验重复 3 次。Western Blot 参照 Ernesto Yague 等5 的方法，将经培养细胞用 Ripa (Ripa lysis buffer)溶细胞缓冲液(50mMTrisHCl(pH7.4) 150mM NaCl、5mMEGTA 1%Triton X100 0.1%SDS)溶解，高速离心取上清，与上样缓冲液 11 混合，经 10%电泳分离，电转移到硝酸纤维薄膜，5%奶粉封闭非特异性位点后，与 150 抗 Pgp 抗体温育 2h，充分洗涤
8、后与 150HRP标记的羊抗鼠 IgG（华美生物工程公司产品）温育 2h，DAB 显色17 细胞内 Rh123 的潴留检测 调整细胞浓度为 1106/ml，加入 Rh123(0.2mg/L)37培养箱共孵育 45min，冷 PBS 洗 2 遍，在 0.5h 内用流式细胞仪检测细胞内 Rh123 的强度或者用共聚焦显微镜检测。相同处理组平行 5 孔，以未经处理的 Bel7402/R 细胞为空白对照。2 结果21 表达针对 MDR1 的 shRNA 和 pshuttle 的设计及构建pshRNAMDR1 重组表达质粒的构建过程以及体内从 DNA 模板产生 shRNA 的策略，见图 1。我们前期构建
9、的 pshMDR1135是在 PGE 1 质粒上插入与 MDR1 同源的 shRNA13 序列构建而成2,3 。MDR1shRNA1 3 的同源序列分别为5GGAGGCCAACATACATGCCTT3、 5GATCGCTACTGAAGCAATAGA3、5GGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGT3。通过对 PGE 1 的酶切位点分析发现在 PGE1 的起点有一个 XhoI 酶切位切点，因此用 XhoI 和 XbaI双酶切可以得到包括 U6 启动子和 shRNA 序列的完整 shRNA 表达单元，大小为 440bp，并且在 pshuttle 的 MCS 上包含此酶切位点，见图 1
10、。对 PGE1 和 pshMDR1 的酶切分析表明该质粒不含 Pme I 和 Pac I 酶切位点。说明该质粒片段可以用来构建腺病毒表示载体。将带 U6 启动子的上述质粒扩增及提取后经电泳、回收和与经同样双酶切 pshuttle 进行连接得到新的重组质粒，分别命名为pshuttle MDR11、pshuttle MDR12、pshuttle MDR13。用PCR 鉴定结果显示在相对分子质量 600bp 左右处有一条明亮的条带，符合阳性克窿的特性，见图 2。将其转染到 SMMC7721/R 细胞内明显的抑制 MDR1 功能的表达，实验结果证明了我们设计的正确性。22 病毒载体的构建及颗粒的包装将
11、构建的 pshuttleMDR1 经 PmeI 酶切成线形质粒，再进行去磷酸化以防止其自身环化，与腺病毒骨架质粒 PAdeasy 共同转化含重组酶的 BJ5183 菌株内完成重组。用卡那霉素条件培养基筛选6出含有目的片段的重组腺病毒质粒。而骨架质粒 PAdeasy 因为是氨苄抗性而不能生长。目前我们已构建了表达 shRNA1 和 shRNA3的腺病毒质粒，分别命名为 PAd MDR11 和 PAd MDR13。构建产物的正确性由以下两个实验说明：（1）将该质粒经 PacI 酶切电泳后产生了 2 条片段，一条为 30Kd 左右, 另一条位于 2.55Kd之间, 符合试剂合说明书要求，见图 3；（
12、2）将该质粒 PacI 酶切产物加入到 AD293 细胞培养后，提取细胞裂解产物进行 PCR,可以得到与 pshRNAMDR1 质粒进行 PCR 的相同结果，见图 2。2.3 PAd MDR1 对的抑制作用将的病毒加入到细胞中，培养一周后进行下述实验证明对MDR1 表达的抑制作用。231 罗丹明潴留试验罗丹明 123 在细胞内的潴留反映了 MDR1 的产物 Pgp 的功能。罗丹明 123 与细胞共培养后经流式细胞仪检测结果提示, PAd MDR11 和 PAd MDR13 转染的细胞平均荧光强度显著高于SMMC7721/R 细胞系细胞，阳性率分别为 91.5%、90.8%，后者阳性率为 29.
13、7%，见表 1。共聚焦结果也显示了彼此之间的差异，见图 4。7232 Pgp 表达的检测用间接免疫荧光法检测细胞膜表面 Pgp，经流式细胞仪检测可见各组细胞的阳性率分别是：SMMC7721/S,26.3%; SMMC7721/R,85.3%; SMMC7721/R+PAdMDR11 22.9%;SMMC7721/R+PAd MDR13,30.8%;SMMC7721/R+PGE1,85.8%（图略） 。Western Blot 结果也表明：2g 相同蛋白量的样品中，经病毒感染的 SMMC7721/R 在 170Kd 处的显色明显低于对照SMMC7721/R，而与 SMMC7721/S 细胞接近，
14、见图 5。表 1 细胞内 R123 的积累量3 讨论为克服肿瘤化疗过程中的耐药性问题, MDR1 的研究一直是热点之一。此前曾经发展起来了针对 MDR1 基因的反义核苷酸技术和针对 MDR1 产物的抗原抗体技术6 。由于 RNAi 技术在基因表达控制方面具有独特优势，本实验室和其他一些实验室纷纷开展了RNAi 用于 MDR1 的研究，技术路线各有差异，包括化学合成siRNA、质粒介导的和病毒介导的体内表达 shRNA 等方法710 。8本实验室自 2002 年以来先期开展了 PGE1 质粒介导的 shRNA抑制肝癌细胞 MDR1 的研究并取得了一些成果。我们针对的MDR1 不同位点设计了三段
15、shRNA 分别作用于耐药肝癌细胞SMMC7721/R 和 Bel7402R，本文中我们又将其中两段shRNA 构建到腺病毒载体上作用于 SMMC7721/R，均取得了较好的抑制 MDR1 效果。应用腺病毒载体进行 RNAi 研究, 我们认为有以下优势:（1）可以感染不同细胞类型。 RNAi 的效果除了受DNA 靶点影响外，细胞间的差异也是重要因素。Christiane Nieth等11用同样 siRNA 分别对胃癌细胞 EPG85257RDB 和胰腺癌细胞 EPP85181RDB 做 RNAi, 结果虽然使 MDR1 mRNA 下降均在 90%左右，但对阿霉素的抵抗两者差别较大（89% vs 58%） 。而Stewart 等12,13则指出：不同细胞处理 shRNA 的能力不同而导致 RNAi 的效果不同；（ 2）可以提高 siRNA 转入细胞效率；（3）即可以转染分裂细胞又可以转染静止细胞，还可以进行活体转染。相信将在后期的动物实验工作中发挥重要作用。【参考文献】 1 Grude P, Conti F, Mennecier D, et al. MDR1 gene expression in hepatocellular carcinoma and the peritumoral 9liver of patients with and without cirrhosisJ.
