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1、1人红细胞冻干前负载海藻糖最佳化研究作者：庄远刘景汉欧阳锡林陈麟凤车辑【摘要 】 为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用，关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性，使胞质内海藻糖达到有效浓度。本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的规律性研究，筛选出海藻糖负载的最佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响。在不同孵育温度（4、22 和 37 ） 、孵育时间（0、2、4、6、8 、10 小时） 、不同负载缓冲液浓度（0、200 、400 、600、800 、1 000 mmol/L）条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标；在固定负载条件下，对新鲜红细胞和 4 保存
2、 72 小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白（FHb） 、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积（MCV）进行了比较。结果表明：红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加，红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。在海藻糖负载最佳条件下，新鲜红细胞和 4保存 72 小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb 浓度分别为 65.5056.314 mmol/L、66.25.002 mmol/L 和 6.5672.568 g/L、 16.1683.922 g/L。结论：红细胞负载海藻糖的最佳条件是2采用新鲜红细胞，在 37条件下、海藻糖浓度为
3、800 mmol/L 的负载缓冲液中孵育 8 小时，这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度，并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性。 【关键词】 红细胞冻干；海藻糖；负载缓冲液Optimization of Trehalose Loading in Red Blood Cells before FreezedryingAbstract The key points for better protection of trehalose in freezedrying red blood cells (RBCs) are to resolve nonosmosis of trehalose to re
4、d blood cells and to make cytoplasmic trehalose to reach effective concentration. This study was aimed to investigate the regularity of loading RBCs with trehalose, screen out optimal loading condition and evaluate the effect of trehalose on physico-chemical parametes of RBCs during the period of lo
5、ading. The cytoplasmic trehalose concentration in red blood cells, free hemoglobin and ATP level were determined at different incubation temperatures (4, 22 and 37), different trehaolse concentrations (0, 200, 400, 600, 800 and 1000 mmol/L ) and different incubation times (2, 4, 6, 8 and 10 hours),
6、the 3cytoplasmic trehalose, free hemoglobin (FHb), hemoglobin (Hb) and mean corpuscular volume (MCV) in fresh RBCs and RBCs strored for 72 hours at 4 were compared, when loading condition was ensured. The results showed that with increase of incubation temperature, time and extracellular trehalose c
7、oncentration, the loading of trehalose in RBCs also increased. Under the optimal loading condition,cytoplasmic trehalose concentration and free hemoglobin level of fresh RBCs and RBCs stored for 72 hours at 4 were 65.5056.314 mmol/L, 66.25.002 mmol/L and 6.5672.568 g/L, 16.1683.922 g/L respectively.
8、 It is concluded that the most optimal condition of loading trehalose is that fresh RBCs incubate in 800 mmol/L trehalose solution for 8 hours at 37. This condition can result in a efficient cytoplasmic trehalose concentration . The study provides an important basis for longterm preservation of RBCs
9、.Key words freezedrying of red blood cells; trehalose; loading solution与传统的血液保存方法相比，冻干红细胞具有很多优点：室温下样品性质稳定、容易再水化、重量大大减轻，易于运输及便于消毒4处理，所以冻干保存有可能成为最有效的红细胞长期保存方法。维持红细胞胞膜完整性是红细胞冻干成功的关键点和难点。在慎重选择红细胞膜的冻干保护剂基础上，必须最大程度发挥冻干保护剂的作用。海藻糖作为细胞保存中首选的保护剂有着不同于其它保护剂的独特作用，在干燥、失水、冷冻、高温、高湿等情况下对生物体或活性分子具有明显的保护作用， 因而被广泛用于细胞保
10、存研究。但由于胞膜对海藻糖的非渗透性，所以一般情况下海藻糖不能透过细胞膜。然而，越来越多的研究显示，只有海藻糖进入细胞内部，在冻干时才能对细胞膜和胞内蛋白起到有效的保护作用1 。因此，红细胞的海藻糖负载既要保证胞内海藻糖达到一定浓度，又要最大限度地避免红细胞损伤。本实验系统地研究了红细胞对海藻糖的负载规律，并对红细胞在此过程中受到的损伤进行了探讨，从而为今后更好地将海藻糖应用于红细胞的冻干保存打下基础。实验试剂与仪器海藻糖（纯度99）购于南宁中诺生物工程有限责任公司。三氯乙酸、浓硫酸购自北京化工厂。ATP 荧光素酶荧光素粉剂为中国科学院上海植物生理研究所研制的产品。蒽酮为北京金龙化学试剂公司产
11、品。如果没有特殊说明，所有的试剂均是分析级。磷酸盐缓冲盐水（PBS） （300 mOsm, pH 7.2）由 154 5mmol/L NaCl, 1.06 mmol/L KH2PO4 和 5.6 mmol/L Na2HPO4组成。负载缓冲液（TPBS）为不同摩尔浓度海藻糖溶于 100 mOsm PBS (pH 7.2)。硫酸 蒽酮试剂为 98%浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中配制成的80硫酸溶液。取分析纯蒽酮 0.2 g 加 80%硫酸溶液 100 ml，使溶解、摇匀，用前配制。MultiskanMK3 型酶标仪( Thermo labsystems 公司产品)；NiHon KoHDEN(MEK610
12、8K 型) 血细胞自动分析仪购自北京高吉科学仪器有限公司。WDD1 型发光光度计为北京第二光学仪器厂产品。红细胞的分离新鲜红细胞 室温（ 22 左右）条件下，用 ACD 三联采血袋 3分钟内采集全血 200 ml，离心（1 007g 转，10 分钟）去除富含血小板血浆（PRP ）及白膜层得到压积红细胞。应用等渗 300 mOsm PBS (pH 7.2)洗涤 3 次（1 007g，10 分钟） ，弃尽上清备用。4保存 72 小时的红细胞 同一批新鲜红细胞 4保存 72 小时，6处理同新鲜红细胞。新鲜红细胞对海藻糖的负载及检测海藻糖的负载 温度试验中，取压积红细胞重悬于 800 mmol/L负载
13、缓冲液中，在不同温度(4、22 及 37)下孵育 10 小时；时间试验中，37在 800 mmol/L 负载缓冲液中分别孵育0、2 、4 、 6、8 、10 小时；浓度试验中，37条件下，在不同海藻糖浓度（0、200、400、600、800 、1 000 mmol/L）负载缓冲液中孵育 8 小时。所有试验中，红细胞最终压积均为 40。在孵育终点取出适量负载红细胞，以 300 mOsm PBS (pH 7.2)洗涤 3 次（1 007g，3 分钟） ，弃尽上清后收集红细胞备检测。胞内海藻糖检测 用硫酸 蒽酮法2 检测胞内海藻糖，加入 3倍体积的 0.5 mol/L 三氯乙酸提取红细胞胞内海藻糖，
14、4放置 1 小时，离心后重复提取 1 次，2 次提取液混合作为胞内海藻糖待测液。取待测液 250 l，加入 1 ml 硫酸蒽酮溶液，冰水浴中摇匀、冷却，沸水精确煮沸 10 分钟，冰水冷却后置室温 10 分钟，测定溶液光密度(OD) 。固定孵育条件对新鲜红细胞和 4保存 72 小时的红细胞的影响7取新鲜红细胞和 4保存 72 小时的红细胞在相同条件处理得压积红细胞，37重悬于不同海藻糖浓度的负载缓冲液（0、200 、400 、600、800 、1 000 mmol/L）中，红细胞最终压积均为 40。同上述操作后进行胞内海藻糖浓度、游离血红蛋白（FHb） 、血红蛋白（Hb）和红细胞平均体积（MCV
15、 ）的测定。各项物理指标测定用红细胞计数仪测定 MCV、红细胞压积（HCT） 、Hb 。游离血红蛋白测定压积红细胞重悬于负载缓冲液中在一定条件下孵育，孵育结束后经 1 007g 离心 3 分钟，取上清液，用 Trinder 反应测定 FHb 浓度。ATP 活性测定用生物发光法测定负载红细胞内 ATP 含量3 。统计学方法8实验数据用(SD）表示，用 SPSS 软件对数据进行配对 t 检验，在进行分析。结 果孵育温度对新鲜红细胞负载海藻糖的影响在 4、22 和 37条件下，孵育 10 小时过程中新鲜红细胞对海藻糖的负载，结果见图 1。由图 1 可见，当温度为 4时，红细胞对海藻糖的负载效率很低，
16、当孵育时间达 10 小时时，胞内海藻糖浓度也仅为 1.25 mmol/L 左右。而随温度的升高，红细胞对海藻糖的吸收明显增加，当温度为 37时，10 小时末胞内海藻糖浓度可达 85 mmol/L。Figure 1. Effect of incubation time at different temperatures on trehalose loading efficiency.孵育时间对新鲜红细胞负载海藻糖的影响37条件下，随孵育时间的延长，新鲜红细胞对海藻糖的负载量呈逐步上升趋势。当孵育时间在 0-6 小时内时，红细胞对海藻糖的摄取效率较低；当超过 6 小时时，红细胞对海藻糖的摄取量明显增9加，但以 6-8 小时内摄取效率最高（图 1） 。胞外海藻糖浓度对新鲜红细胞负载海藻糖的影响研究发现，当胞外海藻糖浓度不断增加并超过等渗条件时，新鲜红细胞对海藻糖的负载效率也相应
