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1、1人红细胞冰冻干燥保存研究的进展【摘要 】 目前红细胞临床保存方法主要有低温（4）和深低温（-80或 -196）保存。4保存时间短，而且容易受到细菌污染；深低温保存大大延长了红细胞保存时间，但需要笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。这些缺陷限制了常规红细胞保存方法在一些特殊情况，例如在战争和自然灾害条件下的应用。相对于常规保存方法而言，冰冻干燥具有以下优势：重量大大减轻，便于运输，适合室温保存，易于再水化。本文就冰冻干燥保存红细胞研究的进展和所面临的挑战，尤其是最近海藻糖在冰冻干燥保存过程中的应用以及其作用机制进行了综合讨论，从而为发展一种安全、简单和有
2、效的红细胞冰冻干燥保存方法提出理论指导。 【关键词】 红细胞Progress in the Study of Lyophilization of Human Red Blood Cells ReviewAbstract Now the clinical preservation methods of human red blood cells mainly include hypothermic storage 2(4) and cryopreservation (-80 or -196). The preservation time of hypothermic storage of red
3、 blood cells is relatively short and it is easy to be contaminated by microbes. Cryopreservation greatly prolongs the storage time，but it needs heavy storage equipments. Because the protective solutions in cryopreservation contain glycerol，red blood cells need complicated washing in order to remove
4、glycerol. These shortage methods limit their application to some special conditions，such as war or natural disasters. Compared with conventional preservation methods of red blood cells，lyophilization has many advantages such as less weight，convenient transportation， room temperature preservation，pro
5、ne to be rehydrated. In this review，the progress and challenge in the development of lyophilization of red blood cells，especially application of trehalose and its mechanism in the lyophilization of red blood cells were systematically discussed. This review can provide some theoretic guidance for dev
6、eloping a safe，simple and efficient preservation approach of red blood cells by lyophilization.Key words red blood 3cell；lyophilization；trehalose；biomembrane红细胞是血液中含量最多的细胞，它通过其中的血红蛋白从肺部携带氧气运送到周边器官，在维持人体正常机能起着重要的作用。红细胞是一种高度分化的细胞，它没有细胞核、线粒体等复杂的细胞器，只有一层质膜包裹着血红蛋白。红细胞对于维持生命具有重要意义，人们由于创伤或其他原因造成大量失血而引起红细胞的
7、丢失时，全身器官会氧气供应不足，从而危及生命。及时输注红细胞是治疗这类病例的有效手段。但是，目前在临床上使用的红细胞保存的主要方法有 4低温和 -80 深低温保存。这些保存技术都有很好的效果，但又存在明显不足：4 保存时间短，最长不过 42 天，而且红细胞容易受到污染，从而造成浪费；-80保存可以将保存时间延长至 10-20 年以上，但需要笨重的超低温冰箱等专门设备，运输不方便，能源消耗大。这些缺陷严重限制了常规保存方法在恶劣自然条件或战时条件下的应用1 。对比之下，冰冻干燥保存的红细胞具有很多优势：便于长期保存，设备重量大大减轻，方便运输，易于消毒，而且在运输过程中不存在振荡性溶血等问题。因
8、此，一旦红细胞冰冻干燥研制成功，必将开创血液供应的新局面。冰冻干燥对于红细胞而言是一个不利的综合影响过程，细胞在此过程中不但要经受冷冻的打击，而且也要受到干燥的损伤。我们的研究结果表明，在冰冻干燥过程中，干燥对于红细胞的损伤占4有主要地位2 。通常，由于干燥而引起的细胞内水分的蒸发使分子间和分子内的联系发生剧烈变化。在一些生物中，当细胞被干燥时，由于水分的缺失，细胞内的蛋白和膜可能通过氢键结合其他分子来取代它们对水分子的结合，这是生物在不利环境的一种保护适应机制。但是如果没有相应的保护机制，则水分的缺失而导致蛋白质与水分子的结合将被蛋白与蛋白之间的相互作用所取代，从而可能造成蛋白不可逆聚集或者
9、发生变性，这会直接导致干燥后细胞死亡3 。研究历史红细胞冰冻干燥保存研究经历三个主要发展阶段。这三个主要发展阶段为：第一阶段：1960 年 Meryman 等 4首次进行人红细胞的冰冻干燥保存研究。由于甘油的粘度过高，所以他没有添加任何保护剂而直接对血液进行冰冻干燥。Meryman 宣称再水化后的细胞回收率为 30-50 。但于 1977 年在一次关于精子冰冻干燥保存研究的研讨会上，与会者承认红细胞质膜在冰冻干燥过程中受到严重损伤5 。通常认为，在 20 世纪 80 年代以前的研究中，从未获得过一个结构完整的冰冻干燥红细胞。5第二阶段：从 1989 年开始冰冻干燥保存红细胞研究进入真正具有临床
10、意义的科学研究阶段。Goodrich 等6，7 在此期间进行了大量实验，先后筛选保护液和再水化液的成分组合，并对保护机制进行初步探索。此后 10 年，在国外红细胞冰冻干燥保存备受重视，如美国，政府投入大量科研基金，1997-1999 年度受美国政府资助的相关研究报告就有 20 篇之多 8 。但这期间，冰冻干燥保存红细胞研究主要是筛选保护剂及温度等物理参数，而没有深入研究冰冻干燥对红细胞超微结构的影响。Goodrich6认为，葡萄糖可以保护红细胞和血红蛋白，而大分子聚合物使保护液呈玻璃化，从而可以有效地保护红细胞。然而，这些研究仍然没有实现冰冻干燥后红细胞可以在室温下长期保存的目标，究其原因主要
11、是大分子聚合物不能进入红细胞内，而只使细胞外液保持玻璃化，所以无法实现对细胞膜的有效保护9 ；另外在室温下样品的氧化问题仍然值得商榷。在此期间冰冻干燥保存的红细胞存活率仅有20-309 。Rindler 等10采用麦芽糖和羟乙基淀粉作为主要保护剂进行搁板温度对冰冻干燥保存红细胞影响的研究，结果表明，随着冻干机搁板温度的下降，冰冻干燥后红细胞溶血率也呈下降趋势，当搁板温度为-35时，溶血率最低，但当进一步降低温度时，溶血率反而上升。尽管 Rindler 的试验结果表明，在冰冻干燥过程中当冻干机搁板温度为-35时的效果最好，但其溶血率仍然达到 85，最后几乎到无可用的红细胞。我们的研究表明，冰冻干
12、燥的问题主要是质膜受损而造成血红蛋白泄漏。当保护液由大分子6聚合物、蛋白和低浓度的渗透性保护剂组成时，冰冻干燥保存红细胞后的上清中游离血红蛋白浓度低于 1 g/L，而且细胞回收率达到80左右，但当将再水化后的红细胞置于 4下保存不同时间，随着时间的延长，溶血率呈上升趋势11 。这说明冰冻干燥对红细胞膜造成损伤。从超微结构来看，采用大分子物质作为主要保护剂进行红细胞冰冻干燥保存后的细胞形态分为 3 类：结构完整（A） 、部分完整(B)和血红蛋白完全泄漏(C)，具体见图 1。第三阶段：进入 21 世纪，研究人员对冷冻和干燥对细胞质膜的影响进行深入的研究12-14 。在此期间海藻糖和蔗糖等二糖在细胞
13、膜保护方面的作用引起人们广泛兴趣。Wolkers 等14 发现，血小板可以通过随温度变化的液相内吞作用吸收海藻糖，吸收效率可以达到 50以上。吸收海藻糖后的血小板冰冻干燥后的存活率为 85，而且对凝血酶、胶原、ADP 和瑞斯托菌素的反应与新鲜血小板相似。受到这项研究的启发，Satpathy 等1 对红细胞对海藻糖的吸收情况进行了初步研究，结果发现随着保护液中海藻糖浓度和孵育温度的变化，红细胞对海藻糖的吸收率也相应的发生变化，当温度为 37时的吸收率最高，但溶血率也随之上升。这些研究为进一步开展红细胞冰冻干燥保存研究提供了理论依据。研究的热点海藻糖7由于红细胞在冰冻干燥保存过程中要经受冷冻和干燥
14、的双重伤害，所以此项研究面临着巨大的困难。海藻糖可能为冰冻干燥保存红细胞开辟新途径。研究人员在一些耐干燥的生物体内发现，当环境极端干燥时其体内海藻糖的浓度可达干重的 20以上。这些生物包括：酵母、一些植物、许多细菌以及一些无脊椎动物（例如水熊等） 。在干燥的环境下，海藻糖或其他的二糖形成一种高度粘稠的玻璃化状态，这有利于这些生物在干燥环境中存活15 。海藻糖的性质及其作用机制海藻糖是一种非还原性二糖16 ，由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基相结合，结构为 -D-Glcp-(11)- -D-Glcp。海藻糖的玻璃化转变温度高于蔗糖和麦芽糖，常温下性质稳定。对于海藻糖保护哺乳动物细胞的作用机制，目前有
15、以下几种观点：Clegg17提出一种水分替代假说，他认为甘油、海藻糖以及其他的碳水化合物和氨基酸等保护成分是作为水分替代分子与氢键结合，从而使细胞免受干燥的伤害。根据这个假说，一些耐干燥生物为了避免干燥损伤而在体内积聚海藻糖或蔗糖等碳水化合物，从而替代水分子和氢键结合，当环境中水分充足时，水分子又重新与氢键结合，而此时细胞内的二糖又可以作为能源代谢物质。20 世纪80 年代，Crowe 等18认为，在海藻糖存在的条件下生物分子8或分子集合体例如细胞膜和蛋白在干燥的环境下可以保持稳定，而且海藻糖的作用效果明显好于其他的糖类。从那时起，海藻糖开始应用于疫苗、脂质体以及人体器官的低温保存，并且取得较
16、好的保护效果。Leslie 等19报道，在海藻糖存在的条件下冰冻干燥保存细菌可以获得较高的存活率。相反蔗糖对细菌的冰冻干燥保存效果很差。这些工作证明了海藻糖是一种特殊的二糖，其对生物细胞的保护作用明显优于其他糖类。Branca 等20 认为，对海藻糖的溶液性质进行研究可能有助于解释海藻糖对生物材料的稳定作用。但是这些性质必须在大量水分存在的条件下才和生物稳定有关联。而在干燥情况下，由于水分几乎全部缺失，所以这个假说无法解释干燥环境下海藻糖对细胞材料的稳定作用。另外，在干燥条件下可降解糖类和蛋白质的所发生的美拉德反应已经被认为是干燥损伤的一个重要原因。海藻糖和蔗糖都是非降解性二糖，这至少可以部分解释为什么在干燥环境中海藻糖和蔗糖可以在一些生物体内积聚，而麦芽糖由于是可降解性二糖，易于发生美拉德反应，因此可能不适合细胞的干燥保存。OBrien 等21 在海藻糖、蔗糖
