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1、1中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体的显示方法【关键词】 神经元 关键词: 神经元;烟碱; 受体，胆碱能 ;抗体;重症肌无力 摘 要: 目的 用重症肌无力（MG）患者的乙酰胆碱受体抗体（AChRab）选择性地显示神经元烟碱型乙酰胆碱受体. 方法 用Elisa 法测定 MG 患者血中的 AChRab 滴度，然后用硫酸铵盐析和免疫亲和层析法提取纯化 AChRab，再用免疫组化法探讨 AChRab与大鼠 CNS 神经元-nAChR 之间的免疫结合反应. 结果 首次表明AChRab 与神经-nAChR 之间的阳性免疫结合反应广泛分布于鼠CNS 许多部位，如大脑皮层、脑干各颅神经运动核团、脊髓运动神经元等部位
2、，与用其他方法显示者其分布一致或类同. 结论 MG 患者 AChRab 可与大鼠和猴 CNS 神经-nAChR 交叉结合;可用于选择性地显示 CNS 神经-nAChR. Keywords:neurons;nicotine;receptors，cholinergic;anti-bodies;myasthenia gravis Abstract:AIM To study the method of expression of neu-ronal nicotinic acetylcholine receptor by acetylcholine receptor antibody purified
3、from myasthenia gravis serum.METHODS ELISA assay was applied to detect the 2acetylcholine recep-tor antibody（AChRab）.AChRab was purified by im-munoaffinity tomography method and was used to study the immunoreaction between acetylcholine receptor antibody and rat central nervous system neuronal nicot
4、inic acetylcholine receptor.RESULTS The positive immunoreaction betweenacetylcholine receptor antibody and central neuronal nicotinic acetylcholine receptor was widely distributed in rat central nervous system，for instance，cerebral cortex，brain stem motor necleus and spinal motor neurons.The distrib
5、ution pattern was consistent with other methods.CONCLUSION AChRab from MG can crossreact with rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor and can selectively express central neu-ronal nicotinic acetylcholine. 0 引言 既往多采用放射自显影、原位杂交和免疫组化法来，研究中枢胆碱能神经系统1-3 .乙酰胆碱酯酶组化和 ChAT 免疫组化法等不能特异性地显示神经-mAChR 和神经-nAC
6、hR.目前用原位杂交和抗神经-nAChR 和 亚单位亚型单抗免疫组化法来研究 CNS 中神经-nAChR 各亚型的分布及其与某些疾病发病机制之间的关系，3但技术操作繁琐，不易广泛推广应用. 分析肌和神经-nAChR 亚型基因组成和结构，发现两者均属于配体-门控-离子通道基因家族，两者的同源性达 80%90%4 .重症肌无力（MG）的 AChRab 可特异性地与肌-nAChR-亚单位主要免疫区结合5，6 .因此，AChRab 也有可能与 CNS 中的神经-nAChR 免疫交叉结合，选择性地显示神经-nAChR.本项研究，先提取纯化 AChRab，然后利用免疫组化法探讨 AChRab 与鼠 CNS
7、神经-nAChR 之间的免疫结合反应，旨在建立一种简便易行的显示CNS 神经-nAChR 的方法. 1 材料和方法 1.1 提取和纯化 AChRab 根据典型的 MG 症状，阳性的抗胆碱酯酶药物试验和血清中 AChRab 滴度测定结果诊断 MG.利用Protein G（Sigma） ，从 3 例 AChRab 阳性的全身型 MG 患者血中提取纯化 AChRab.3 名健康者为正常对照. 1.2 免疫组化 选成年 SD 大鼠各 20 只，平均体质量250 300g.用戊巴比妥深度麻醉，左心插管，用 40g L-1 的冷（4）多聚甲醛液 400mL 灌注固定 2030min; 迅速取脑，入200g
8、 L-1 蔗糖溶液 1d.取全脑续列冰冻切片，40m 厚，入 3g L-1 TritonX-100，室温下 30min，然后用 KPBS（0.01mol L-1 ）4洗 3 次，15min/次;然后分别用 AChRab（KPBS1 100 稀释）和从健康人血中提取的 IgG，4 下孵育 48h， KPBS 洗 3 次，15min/次; 用生物素化羊抗人-IgG （武汉博士德公司）室温下孵育切片4h，KPBS 洗 3 次，15min/次; 最后用生物素 -亲和素（Sigma）室温下孵育切片 3h，KPBS 洗 3 次，15min/次.用二甲基联苯铵-硫酸镍铵加强法呈色，适时终止反应. 2 结果
9、免疫组化结果显示，AChRab 和神经元-nAChR 之间的阳性免疫结合反应弥散地分布于鼠 CNS 许多部位.各部位神经元-nAChR样阳性免疫结合反应强弱有别，有些部位呈强阳性，而在另一些部位则呈中等或弱阳性反应，甚至无阳性反应.大脑皮层除分子层中无阳性反应外，第，及层中均有神经元-nAChR 样阳性免疫结合反应，其中第 V 层大锥体细胞呈强阳性反应，并发出长长的突起伸向皮层表面，至第皮层和层，而第层阳性反应神经元相对稀少（Fig1A）;梨状皮层部分神经元也呈强阳性反应;海马皮层锥体细胞胞体呈较强阳性反应，突起阳性反应相对弱，而且海马不同区，如 CA1，CA2 及 CA3 区阳性反应强度不尽
10、相同;丘脑各核团神经元呈中等阳性反应，而在丘脑网状核中却能看到边界清楚着色较深的强阳性反应神经元（Fig1B）;下丘脑室旁核、视上核（Fig1C） 、中脑黑质致密部（Fig1D） 、三叉神经中脑核（Fig1E）5等均呈强阳性反应;脑干颅神经核团呈中-强阳性反应，如面神经核（Fig1F）;脑干网状结构巨细胞部神经元胞体及突起呈强阳性反应，可看到许多清晰的突起伸向邻近结构（Fig1G）;在小脑可看到轮廓清晰的浦肯野细胞胞体及伸向小脑皮层的突起，呈强阳性，而在颗粒层中却没有见到阳性免疫结合反应（Fig1H）.图 1 略 3 讨论 3.1 AChRab 与肌和神经nAChR 之间的免疫反应机制 肌-n
11、AChR 是由 21，2， ， 亚单位组成的五聚体.用肌-nAChR-亚单位单抗，已从多种脊椎动物 CNS 中提取纯化了神经-nAChR 样蛋白. 用神经 -nAChR 和 亚单位单抗研究发现，神经-nAChR 亚单位 2，3，4 ，5，6，7，8 和 2，3，4 亚型广泛分布于脊椎动物 CNS 许多部位，如脊髓、脑干、下丘脑、丘脑、大脑皮层、海马、小脑等7 .本项研究首次表明，AChRab 可与神经-nAChR 免疫交叉结合，并发现与大鼠 CNS 神经-nAChR 亚单位3，7，8 亚型分布相符 2，3 .AChRab 与神经-nAChR 交叉结合的机制:肌和神经-nAChR 两者均属于配体
12、-门控-离子通道基因家族;人类的神经-nAChR 和 亚型与多种动物的神经-nAChR 亚型肽链之间高度同源. 如将人的 7 亚型多肽链与大鼠的神经-nAChR 比较，同源性高达 80%90%，而人的 3 亚型与大鼠的 3 亚型之间同源性高达 93%8，9 . 6现主要根据放射自显影、原位杂交和抗 ， 亚单位单抗免疫组化法来研究 CNS 中神经-nAChR 亚型的分布1-3 .神经-nAChR 受体激动剂或拮抗剂，对由不同亚型组成的受体亲和力不同，放射自显影结果不同，由此推断 CNS 中神经-nAChR 亚型的分布.上述方法有一定的局限性，仍不能准确地显示 CNS 中神经-nAChR亚型的分布
13、.迄今为止发现的选择性高，且特异性强的配体数量有限，很难显示全部受体亚型.原位杂交只能显示胞核或胞质内的某一亚型mRNA.如在研究帕金森氏病与神经-nAChR 之间的关系时发现，免疫组化结果证实患者 CNS 中神经-nAChR 明显减少，但原位杂交却发现患者 CNS 中神经-nAChR 亚型 mRNA 量并没有减少，提示患者 CNS 中神经 -nAChR 量的减少与受体亚型 mRNA 转录翻译过程有关10 . 3.2 研究首次表明 AChRab 可与 CNS 神经nAChR 交叉结合 可利用此特性选择性地显示神经-nAChR;结果表明 AChRab 可与神经-nAChR 中的一种或多种受体亚型
14、结合，不同脑区免疫反应程度不同，提示 AChRab 与不同脑区的神经-nAChR 亲和力不同. 参考文献: 1Rubboli F，Court JA，Sala C，Morris C，Chini B，Perry E，Clementi F.Distribution of nicotinic acetylcholine 7receptors in the human hippocampus and thalamus J.Eur J Neurosci，1994;6（10）:1596-1604. 2Wada E，Wada K，Boulter J，Deneris E，Heinemann S，Patrick
15、J，Swanson LW.Distribution of alpha2，alpha3，alpha4and beta2neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system:A hybridization histochemical study in the rat J.J Comp Neurol，1989;284（2 ）:314-335. 3Dominguez del Toro E，Juiz JM，Peng X，Lindstrom J，Criado M.Immunocytochemical localiza
16、tion of the rat central nervous system J.J Comp Neurol，1994;349（3）:325-342. 4Whiting PJ，Schoepfer R，Conroy WG，Gore MJ，Keyser KT，Shimasaki S，Esch F，Lindstrom JM.Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina J.Brain Res Mol Brain Res，1991;10（1）:61-70. 5Vincent A，Newsom-Davis J.Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for
