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1、一、室常见细胞系细胞培养基应用选择细胞系细胞类型种 组 织 培养基293成纤维细胞人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清HeLa上皮细胞人子宫颈癌MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA(in suspension, S-MEM)HEp-2上皮细胞人 喉癌MEM, 10% 胎牛血清;或 RPMI-1640, 10% 胎牛血清K-562成淋巴细胞人骨髓性的白血病RPMI-1640, 10% 胎牛血清BHK-21成纤维细胞仓鼠肾GMEM, 10% 胎牛血清 或 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAACHO-K1上皮细胞仓鼠卵巢 F-12,10%胎牛血清Vero成纤维细胞猴非洲绿猴肾199 培
2、养基， 5%胎牛血清RAW264.7小鼠单核巨噬细胞小鼠腹水DMEM 高糖培养基，10%FBS,1%P/SPK-15上皮细胞猪 肾 EMEM+10%Hyclone 灭活血清MDBK上皮细胞牛 肾RPMI1640(w/oHepes)优质胎牛血清，10%PIEC内皮细胞猪 髋动脉 RPMI，胎牛血清 10%二、冻存和细胞复苏的方法步骤细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH 值改变，部分蛋白质由于上述原因而变
3、性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核 DNA 空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减
4、少冰晶对细胞的损伤。二、细胞冻存操作步骤：(1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用 0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10 分钟) 。(2)去上清液，加入含 20%小牛血清的完全培养基，于 4预冷 15 分钟后，逐滴加入已无菌的 DMSO 或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为 31061107/mL 之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装 11.5m
5、L 在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数 )。(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入 4冰箱中 23 小时，再移至冰箱冷冻室内 34 小时(此步可省略) ，再吊入液氮容器颈气态部分存放 2 小时，最后沉入液氮中。细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。三、常用冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有 35
6、L3 和 50L3 两种。使用时要注意以下几点：(1)一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196 ，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。(2)液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。(3)在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含 10%20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121C 蒸气高压消毒)，2mL 安瓿( 或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布
7、袋(或冻存管架)等。细胞的复苏一、细胞复苏的原则在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。二、细胞复苏的主要操作步骤(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2)迅速放入 38水浴中，并不时摇动，在 1 分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。(3)在 1000r/min 速度下离心 510 分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度 1109/L，置 37温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接
8、将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养 1224 小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。三、注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-50) 。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。三、鼠巨噬细胞 RAW264.7 为例，具体介绍细胞培养技巧RAW264.7 是由 Abelson 鼠白血病病毒诱导 BALB/c 小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得
9、到的细胞株。该细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，是微生物学、免疫学研究中的常用细胞株。RAW264.7 细胞培养之前，一切与该细胞直接接触的玻璃器皿和器具都要进过去热处理 （200-250烘烤 4-6h） ，RAW264.7 细胞接触过多的热源会导致巨噬细胞形态发生明显变异，影响实验中的观察。培养细胞的相关试剂在分装时也尽量减少热源的污染。这样，RAW264.7 细胞的状态才可能达到最好，确保实验的可靠性和真实性。RAW264.7 细胞是类单核的细胞，最好的形态是 小的圆形透亮的细胞。极易出现多伪足的细胞形态，这是造成很多研究者困惑的原因，同时这也是之后细胞的消化和传代困难的根源。RAW26
10、4.7 具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促使细胞伸出伪足，增强黏附攀爬能力。胰酶的消化效果与细胞的形态有紧密的关系。细胞的伪足多而长，会使细胞很难消化，用细胞刮对细胞损伤较大，需要的贴壁的时间更长，增值速度也会很慢。因此往往RAW264.7 的消化是传代中工作量最大的步骤。经验做法：1）待培养瓶中 RAW264.7 细胞的密度达到 80%，弃去培养基；2）用 HBSS 洗液洗涤两次，完全去除含胎牛血清的培养基（以免影响胰酶的消化效果）；3）0.25%胰酶消化 5-10min。形态好（指小、 圆形）的细胞 5min 就可达到理想的消化效果；4）弯嘴吸管稍用力均匀吹打，
11、重复一次，即可将 RAW264.7 细胞吹打下来。但是形态不好（多触角、 长梭形）的细胞即使消化 10min 后，镜下观察，悬浮的 RAW264.7 细胞都很少，这时的细胞状态就不太好，对后续的实验有较大的影响。四、吞噬实验将 RAW264.7 细胞接种于细胞培养板中，待细胞长成单层后，用 PBS 洗涤 3 次，加入无抗的 DMEM 培养液（Hyclone） ，加入培养至对数生长期的细菌，使 MOI 达到 10:1（细菌：细胞） ，于 37作用 30min。吸出培养液，用 PBS 洗 3 次，加入 DMEM 培养液（含 100 微克/毫升氨苄青霉素）用以杀灭结合于细胞表面的细菌。孵育 2h 后
12、，用 PBS 洗涤细胞 3 次后，用无菌双蒸水裂解细胞。对细胞裂解液进行梯度稀释，将其涂布在含有 10%灭活牛血清的 TSA 的培养基上，37培养过夜，确定其中含有的细菌数目。五、粘附与侵入实验将 Hep-2 细胞接种于细胞培养板上，待细胞长成单层后，用 PBS 洗涤 3 次，加入无抗的DMEM 培养液（Hyclone） ，加入培养至对数生长期的细菌，使 MOI 达到 100：1，于 37作用 2h。吸出培养液，用 PBS 洗 3 次，用无菌双蒸水裂解细胞，对细胞裂解液进行梯度稀释，将其涂布在含有 10%灭活牛血清的 TSA 的培养基上，37培养过夜，以计算侵入细胞内的和粘附于细胞表面的总细菌数目。对于仅计算侵入细胞内的细菌数目，PBS 洗涤后，加入 DMEM 培养液（含 100 微克/ 毫升氨苄青霉素）处理细胞 2h，后用无菌双蒸水裂解细胞，进行培养计数。六、细胞毒性实验
