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1、 DNA检验技术在法医的应用 及亲子鉴定 1 DNADNA检验技术在法医的应用检验技术在法医的应用 一 DNA存在的部位 细胞有原核细胞和真核细胞之分 原核细胞比真 核细胞小 结构也简单得多 它除了表面的细胞膜以外 没 有成形的细胞核 也没有其他细胞器 但有一个被称为染色 体的环状DNA分子 它和RNA 酶等组成一个基因转录转译系 统 此外 细胞质中还可含有一些小分子DNA 称为质粒 真 核细胞比原核细胞大 有细胞膜 植物细胞膜外还有细胞壁 细胞核 包括核膜 核质 染色质及核仁等 细胞质 细胞器 线粒体等 高等动物由真核细胞组成 有二套遗传物质 即 DNA 一套位于细胞核染色质内 一套位于细胞
2、器线粒体内 细胞的遗传物质没有组织特异性 有个体 种属特异性 2 真核细胞染色质的主要成分是DNA和蛋白质 人的每个体细胞有23对46条染色体 为双倍体 其中22对44条为常染色体 男女共有 另外一对决 定性别 为性染色体 女性为XX 男性为XY 每对 常染色体中之一分别来自父 母亲 叫做同源染色 体 人的精子及卵子中仅有23条染色体 为单倍体 以着丝粒为界 每一条染色体的两臂分别命名为 p 短臂 及q 长臂 p q两臂以着丝粒为中心 又细分为区 带等 见下图 线粒体是细胞呼吸及能量代谢中心 含有 DNA及核糖体 有自己的一套遗传系统 能按照自 己的DNA信息编码合成一些蛋白质 组成线粒体的
3、蛋白质约有10 就是由线粒体本身DNA编码合成的 3 4 5 二 遗传标记 1 遗传多态性 genetic polymvr phism 在随机交配无血缘关系的群体中 个体的 一种遗传性状存在两种以上具有相对差异类型 的现象称之为遗传多态性 2 平衡多态性 遗传多态性可能以不同的类 型按一定比例在几代仍维持不变称为平衡多态 性 3 遗传标记 具有平衡多态性的遗传性状 作为标志用以识别携带它的个体 细胞 染色 体或用以研究家系和群体的遗传方式时 称为 遗传标记 遗传标记分为 表型 基因和基因型 6 基因 是指位于染色体上的一段DNA序列 能够 表达出特定的功能 决定特定的遗传性状 基因座 基因在染
4、色体上的位置 等位基因 位于同源染色体上 相同座位的一对 基因称为等位基因 基因型 genotype 是指该基因座上成对等位基 因的组成 纯合子与杂合子 一个基因座上成对的等位基因相同时 称该基 因座为纯合子 不同时称为杂合子 表型 pheno type 是指通过一定手段观察到的 个体性状 7 三 DNA的结构与理化特性 1 DNA的基本结构 DNA的基本结构单位是核苷酸 由磷 酸 糖和碱基组成 核酸分为脱氧核糖 核酸 deoxyribonucleic acid 和核糖 核酸 ribonllcleic acid 两大类 每一个核苷酸分子含有一个戍糖 核 糖或脱氧核糖 分子 一个磷酸分子和 一个
5、含氮的有机碱 8 有机碱分子分两类 一类是嘌呤 一类是嘧啶 嘌呤包括腺嘌呤 adenine A 鸟嘌呤 guanine G 嘧啶包括 胸腺嘧啶 thymine T 胞嘧啶 cytosime C 尿嘧啶 uracil U 戍糖分子上第一位碳原子与嘌呤或嘧啶结合 就成为核苷 如果是脱氧核糖形成的核苷就 是脱氧核糖核苷 如果戍糖是核糖 形成的核 苷就是核糖核苷 9 一个核苷与一个磷酸的分子结合 就构成一个 核苷酸 nucleotide nt 磷酸与核糖或脱氧核 糖结合的部位通常是核糖或脱氧核糖的第3位或 第5位碳原子 即3 端和5 端 多个核苷酸以磷酸顺序相连而成长链的多核苷 酸分子 即构成核酸的基
6、本结构 一般核苷酸链 少于50个核苷酸的称为寡核苷酸 DNA的碱基构成有4种 A G T C RNA的碱基构成为A G U C 4种 DNA分子是双链的 这两条链的走向是相反的 是反平行的 10 多核苷酸长链是通过磷酸和戍糖的3 5 碳原子共价相连而成的 因此长链的两端是不 同的 一端是3 端 3 C OH 一端是5 端 5 C PO4 DNA分子的一条长链是以5 到3 另一条长链是从3 到5 两链的碱基互相以氢链相连成对 这就是碱 基对 basepair bp 一般用bp数表示DNA分 子大小 A总是与 T配对 A T之间以2个氢键相连 G总是与 C配对 G C之间以3个氢键相连 DNA二条
7、长链不是直线形的 而是互相缠 绕而成螺旋形的分子 11 12 13 真核细胞中的DNA碱基序列 很多都是没 有表达功能 没有基因的特征 不能表达为 蛋白质 即为内含子 intron 有基因功 能的不超过10 为外显子 exon 人有46条染色体 约有40亿碱基对 人 DNA有基因功能的不过10 真核细胞DNA的 另一个特点是有许多重复的碱基序列 人线粒体DNA为双链环状 2 DNA的复制与变性和复性 1953年Waston和Crick提出DNA双螺旋模 型及DNA自我半保留复制学说 14 DNA复制过程 DNA分子2条链分开成单链 每一条链上所露出来的碱基各自与一 个游离核中的互补核苷酸碱基相
8、连 即A 和T G和C相连 在DNA聚合酶的催化下形成新链 新 链由一条旧链和一条新链组成 15 DNA的变性和复性 双链DNA加热至生理温度以上 接近 100OC 数分钟时 双链间氢键断裂 最 后双链完全分开并成为无规线团 这一 过程叫做DNA变性 denaturation 或融 解 又称为热变性 加热 过高或过低的PH 有机溶剂 尿素 甲跣胺等试剂均可使DNA变性 PH 过高引起的变性称为碱变性 16 DNA变性是可逆的 只要消除了变性条 件 分开的两条互补链又可重新结合 恢复原来的链结构 这过程称为复性 根据核酸分子变性和复性的性质 通 过碱基配对使不同来源的两条多核苷酸 链的相互结合称
9、为核酸的分子杂交 hybridization 17 四 DNA多态性检验 DNA多态性 DNA Polymorphism 是指一定染 色体一定部位DNA碱基长度或组成在人群中存在差 异 DNA多态性形成的主要原因是基因的突变 法 医学应用的DNA多态性分为长度多态性 length polymorphism 和序列多态性 sequence polymorphism 两类 前者指等位基因间片段长度 差异 后者指等位基因间的碱基序列差异 法医学所用长度多态性的结构基础是串联重复 序列 特征为一段称为基序 motif 的DNA呈串联 重复排列 18 按基序长短及产生多态性的机制 可以简单 分为小卫星D
10、NA和微卫星DNA 若基序数增减主要 由不等交换机制产生 则基序较长 如8 100bp 称为小卫星DNA minisatellite DNA 或可变 数目串联重复序列 variable number of tandem repeats VNTR 若基序数增减主要由复制滑脱 机制产生 则基序较短 如2 6bp 称为微卫星 DNA microsatellite DNA 或短串联重复序列 short tandem repeats STR 基序的序列是相 对不变的 不同个体间不同的是基序的重复次数 例如 小卫星DNA中基序的重复次数在不同个体 间的变化极大 在一些个体可能是数十次左右 在另一些个体可能
11、是数百次 这种DNA的高度变异 性是进行个体识别和亲子鉴定的基础 19 一 长度多态性分型 长度多态性是个体遗传特征在群体中 的反映 对个体遗传标记的表型或基因型 分型的技术方法分为限制性片段长度多态 性 restriction fragment lengthpolymorphism RFLP 和扩增片段长 度多态性 ampli fication fragment length polymorphism Amp FLP 20 1 限制片段长度多态性 从不同的组织或细胞中获取大分子的DNA 一般采用蛋白酶K消化 酚和氯仿抽提蛋白 质 乙醇沉淀DNA的方法 对提取到的DNA定量 后 经限制酶切割成
12、大小不同的片段 琼脂糖 电泳分离后按分子大小排列 用特定DNA探针 与含有串联重复序列的DNA片段进行Southern 杂交并自显影 不同个体串联重复的基序数目 不同 自显影胶片上显示的片段大小就不同 限制片段长度多态性检测主要包括以下步骤 21 1 DNA的限制性酶切 用适当的限制酶切割 DNA分子 选择限制性内切酶的原则是 重复 序列中无该限制酶的酶切位点 以保证重复序列 的完整性 选择具有较少识别序列的酶 酶切 所产生的片段不至于太多 容易由电泳分离 2 DNA限制性片段的电泳分离 3 DNA片段的Southern印迹 电泳分离后 切片段转移到支持膜上 选用的支持膜通常是硝 酸纤维素膜或
13、尼龙膜 此法最先由Southern建立 故称为Southern印迹法 用碱使支持膜上DNA 变性 解链成单链分子 再进行分子杂交 22 4 分子杂交 固定在支持膜上的变性DNA片 段与DNA探针进行分子杂交 DNA探针是已知核苷 酸序列的带有标记物的单链DNA片段 DNA探针的 标记物分为两类 放射性同位素标记和非放射性 物质标记 后者主要有辣根过氧化物酶 地高辛 碱性磷酸酶 生物素及光敏生物素等 采用缺 口平移法 随机引物延伸法 末端标记法及光化 学标记法等标记到单链DNA分子上形成探针 5 杂交信号的显示 杂交后洗去游离的探针 膜与X射线片重叠 置于暗匣中 杂交DNA片段 中的DNA探针通
14、过放射自显影使X射线片感光 X射 线片显影后在杂交DNA片段对应位置出现黑色条带 得到DNA图谱 不同个体串联重复的基序数目不 同 23 法医RFLP分析的是基因组小卫星DNA 根据探 针特性有两种类型 一种是多基因座探针 multi lo cus probe MLP 可以同时与多个小卫星的 VNTR杂交 形成多基因座RFLP图谱 称为DNA指纹 DNA fingerprint 另一种是单基因座探针 single lo cus probe SLP 仅与一个小卫星基 因座的等位片段杂交 形成单基因座RFLP图谱 称 为DNA纹印 DNA pfrie DNA纹印中的单基因座探针含有特定基因座的 单
15、拷贝序列 杂交时使用高度严格的条件 一个探 针只能检测一个小卫星区域 形成单个基因座的 RFLP图谱 图谱中杂合子呈现为两条带 纯合子呈 一条带 DNA纹印电泳时要加已知长度的DNA片段作 为相对分子质量标准 通过自动扫描设备识别并构 建回归方程 等位片段长度由回归方程估计 24 与DNA纹印不同 DNA指纹的技术核 心是多基因座探针 multi locus probe MLP 探针由小卫星的串联重复序列 构成 人类基因组中一系列小卫星DNA的 核心序列具有相似性 在不严格的杂交 条件下 相似但并不完全相同的串联重 复序列都可以与探针结合 从而能同时揭 示多个小卫星基因座的多态性 形成DNA
16、指纹 25 2 扩增片段长度多态性 扩增片段长度多态性 amplification fragment length polymorphism Amp FLP 指通过PCR扩增对 基因组中有长度多态的基因座分型 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 是一种模拟天然DNA复制过程而建立的体外 核酸扩增方法 PCR原理是利用DNA聚合酶的催化作 用 以靶DNA作为模板 由一对引物引导DNA合成 使两引物间的靶DNA片段得到特异性的扩增 扩增 产物的特异性由引物的序列所决定 所谓引物 primer 人工合成的与待扩增的DNA片段互补的单 链寡核苷酸片段 26 根据PCR原理 针对具有长度多态的串联重复序列的侧翼 序列设计一对引物 PCR扩增后 电泳分离PCR产物 杂合子 扩增产物为两条长度不等的片段 纯合子为一条片段 Amp FLP分析技术充分发挥了PCR技术的高灵敏度和 串联重复序列高多态性的优势 在检测灵敏度 准确性 技 术程序上比RFLP优越 使法医DNA分析实现了高效 灵敏 准 确的目标 在法医工作中应用最多的是短串联重复序列 short tand
