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1、1不同复性方法制备的 rhBMP作者：赵玮钦，陈苏民，王涛，张晓楠，王丽【关键词】 重组人骨形成蛋白 2 成熟肽；,高密度发酵；,蛋白质纯化；,蛋白质复性Comparison of different refolding methods in inducing ectopic bone formation by rhBMP2m【Abstract】 AIM: To refold recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide (rhBMP2m) by different methods, and compare the a
2、ctivity of inducing the formation of ectopic bone. METHODS: The engineered strain, which could express rhBMP2m at a high level, was fermented in high density, and induced by temperature. The bacterial cells were collected and lyzed. The gained inclusion bodies were purified by ionexchange chromatogr
3、aphy. The purified rhBMP2m was refolded by three different methods: rhBMP2m was dialyzed with pH 4.8 buffer for refolding. rhBMP2m was refolded by means of dilution method in pH 9.0 buffer. rhBMP2m was dialysed in pH 6.5 buffer to 2refold. It (1 mg) was planted into mouse muscles to observe the form
4、ation of bone without any carrier. RESULTS: The purity of the acquired rhBMP2m was 98% after ionexchange chromatography. The resulting rhBMP2m was soluble after refolding with pH 4.8 buffer and had no any loss after passing through sterilizing filter membrane. When 1 mg of the lyophilized rhBMP2m wa
5、s planted into mouse muscles, it induced ectopic cartilage after 2 weeks and trabecular bone after 4 weeks. rhBMP2m was soluble after refolding with pH 9.0 buffer. The refolded rhBMP2m seemed dissolvable by macroscopic observation, but lost over 90% after filtrating sterilization.After 1 mg of this
6、lyophilized rhBMP2m was planted into muscles, cartilage appeared after 1 week, bone formed after 2 weeks, and trabecular bone was seen after 3 weeks. After dialysis, rhBMP2m was precipitated. When 1 mg of insoluble rhBMP2m was planted into muscles, it induced trabecular bone in 2 weeks and myeloid c
7、ells after 4 weeks. CONCLUSION: Compared with acid and alkaline condition, rhBMP2m refolded in neutral condition has the best activity of inducing the formation of bone, but rhBMP2m refolded in acid condition has better dissolubility.3【Keywords】 human bone morphogenetic protein2 mature peptide; high
8、 density fermentation; protein purification; protein refolding【摘要】 目的：用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白 2成熟肽(rhBMP2m)，比较其异位诱骨活性. 方法：将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化. 纯化后的 rhBMP2m 用三种不同方法复性： 对 pH 4.8 复性液透析复性；对 pH 9.0 复性液稀释复性；对 pH 6.5 复性液透析复性. 不加任何载体，1 mg 复性后 rhBMP2m 直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成. 结果：得到纯度为 98的 rhBMP2m. pH 4.
9、8 透析复性后蛋白可溶 . 经过滤除菌，可溶性 rhBMP2m 没有损失. 冻干后植入肌袋，2 wk 后诱导生成软骨，4 wk 诱导生成骨小梁. pH 9.0 稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶，但经除菌膜过滤rhBMP2m 损失 90%以上. 冻干后植入肌袋，1 wk 诱导生成软骨，2 wk 诱导软骨内成骨，3 wk 出现骨小梁. pH 6.5 透析复性后蛋白不可溶，植入肌袋，2 wk 诱导生成骨小梁，4 wk 后出现骨髓样细胞. 结论：相比酸性和碱性条件，中性条件下复性的 rhBMP2m的诱骨活性最好，但酸性条件下复性的 rhBMP2m 溶解度好.【关键词】 重组人骨形成蛋白 2 成熟肽；
10、高密度发酵；蛋白质纯化；蛋白质复性40引言重组人骨形成蛋白 2 成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide, rhBMP2m)，属于转化生长因子 （transforming growth factor, TGF）超家族，它在骨骼再生与修复过程，以及胚胎发育的不同阶段发挥着重要的作用1. 目前，rhBMP2m 已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括治疗骨质缺损、颌面修复等. 利用哺乳动物细胞制备rhBMP2m，其表达水平很低 ,纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用. 利用大肠杆菌表达 rhBM
11、P2m，获得包含体，体外复性后可以得到具有生物活性的 rhBMP2m2 . 但是其复性过程复杂，总收得率低，复性缓冲液所要试剂昂贵. 本研究采用三种不同的复性方法，通过动物试验比较不同方法复性的 rhBMP2m的诱骨活性，为获得一种简单而且廉价的方法以改进活性rhBMP2m 的生产.1材料和方法1.1 材料雄性健康昆明小鼠 12 只，体质量 1822 g，由第四军医大5学实验动物中心提供；溶菌酶，DNase 购自美国 Invitrogen 公司；菌种 DH5/pDH2rhBMP2m，BCA 蛋白定量试剂为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室配制并保存；低分子量蛋白 marker购自上海生化所
12、； 15 L 全自动发酵罐购自美国 NBS 公司；SPSepharose FF，QSepharose FF 购自瑞典 Pharmacia 公司；低分子蛋白透析膜（截留分子量 10 000）购自北京华美公司；超声粉碎器购自美国 Cole Parmer Instrument 公司；低温高速离心机购自湖南湘西仪器仪表厂；MinitanTM 超滤系统购自美国 MILIPORE公司；SDSPAGE 垂直平板电泳系统购自美国 BIORED 公司；冻干机购自丹麦 HETO 公司； 0.22 m微孔滤膜来自上海兴亚净化材料厂.1.2 方法1.2.1DH5/pDH2rhBMP2m高密度发酵、裂菌、包涵体洗涤取-
13、70保存的DH5/pDH2rhBMP2m工程菌株甘油菌种， 划 LB 琼脂平板， 含 100 mg/L 氨苄青霉素， 32培养 20 h. 挑单菌落入 6 mL LB，30摇床培养 16 h. 转入 300 mL LB，30摇床培养 10 h. 转入 15 L 发酵罐 30培养, 计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30培养 16 h. 发酵罐内 42诱导表达 4 h，结束发酵. 裂解缓冲液6(100 g/L 蔗糖，10 mmol/L pH 8.0 TrisHCL，1 mmol/L EDTA)悬浮菌体，加溶菌酶，冰浴中超声裂菌，离心后收得包涵体. 洗涤液(5 g/L TritonX100，10 mm
14、ol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮包涵体,超声处理, 离心收集包涵体,反复 4 次.1.2.2 包涵体纯化SPSepharose FF 阳离子柱层析分离：洗涤后的包涵体溶解于 SPbuffer（8 mmol/L 尿素，20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L 巯基乙醇）中，上 SPSepharose FF 阳离子柱，用不同浓度 NaCl 溶液洗脱，透析除去尿素，离心收集沉淀. QSepharose FF 阴离子柱层析纯化：将 SPSepharose FF 柱层析纯化的蛋白质沉淀溶解于 Q buffer（8 mol/L 尿素，2
15、0 mmol/L pH 9.0 Tris，0.014 mol/L 巯基乙醇）中，上 QSepharose FF 阳离子柱，用不同浓度 NaCl 溶液洗脱，收集各蛋白峰，透析除去尿素和 巯基乙醇，离心收集沉淀 .1.2.3 蛋白复性pH 4.8 透析复性 rhBMP2m：纯化后的 rhBMP2m 经变性液（8 mmol/L 尿素，20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L 巯基乙醇）溶解,装入透析袋内,对 pH 4.8 的复性液7透析（10 mmol/L pH 4.8 NaAc，50 mmol/L NaCl） ，换液多次以彻底去除尿素和 巯基乙醇 . 透析复性结束后收
16、集复性蛋白液，复性的蛋白液可通过 0.22 m微孔滤膜除菌，或进一步浓缩和冰冻干燥. pH 6.5 透析复性 rhBMP2m：纯化后的 rhBMP2m 经变性液（8 mmol/L 尿素， 20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L 巯基乙醇）溶解,装入透析袋内，对 pH 6.5 的复性液透析复性 24 h，换液 2 次以彻底去除尿素和 巯基乙醇. 透析复性结束后收集离心复性后沉淀的蛋白质. pH 9.0 稀释复性 rhBMP2m：纯化后的 rhBMP2m 用变性液（8 mmol/L 尿素， 20 mmol/L TrisCl pH 8.5, 0.014 mol/L 巯基乙醇）溶解后，1 次倾倒入 10倍体积的复性液（20 mmol/L TrisCl pH9.0，0.5 mol/L 精氨酸，10 mmol/L 还原型谷胱甘肽，1 mmol/L 氧化型谷胱甘肽） ，同时
