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1、2008, Vol.32, No.5223ProgressinPharmaceuticalSciences2008年第32卷第5期第 223 页s2008-03-21 YT:平其能,教授,博士生导师;Z_:药物新剂型与新技术;Tel:025-83271098;E-mail:多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及体外评价张晓燕,平其能(中国药科大学药学院药剂学教研室,江苏南京 210009)K1:制备多西紫杉醇白蛋白纳米粒,考察白蛋白和多西紫杉醇的处方量及乙醇加入量等因素对其形态、粒径、Zeta电位、收率、包封率、载药量和体外释药特性的影响,并对处方工艺进行优化。ZE:采用去溶剂化-化学交联法制备多西紫
2、杉醇白蛋白纳米粒,透射电镜观察纳米粒形态,马尔文激光粒度仪测定其粒径分布及Zeta电位,考马斯亮兰-酶标仪法测定纳米粒收率,HPLC法测定纳米粒包封率和载药量;以累积释药百分率为指标,通过方程拟合释药曲线,考察制剂的体外释药特性。处方优化采用星点设计-效应面优化法,应用SAS统计软件对数据进行处理。T:优化处方制得的纳米粒为类球形,平均粒径 65.3nm,Zeta电位-31.4mV,纳米粒收率 95.0%,包封率 74.3%,载药量 4.65%,制剂 24小时体外累积释药百分率为 74.4%。:难溶性抗癌药物多西紫杉醇可以采用去溶剂化-化学交联法制备成白蛋白纳米粒,其粒径小,稳定性高,可显著提
3、高多西紫杉醇在水相中的浓度。其优化处方中药物的释放显著慢于原料药磷酸盐缓冲溶液的释放,具有缓释效果。1oM多西紫杉醇;白蛋白纳米粒;去溶剂化-化学交联法;体外释放;星点设计-效应面优化法ms|R944,R943,R927.2DSMAcI| 1001-5094(2008)05-0223-06PreparationandInVitroEvaluationofBovineSerumAlbuminNanoparticlesContainingDocetaxelZHANGXiao-yan, PINGQi-neng(DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,Ch
4、inaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)AbstractObjective:Toprepareandevaluateinvitrobovineserumalbuminnanoparticlescontainingdocetaxel(DT-BSA-NPs)andtooptimizetheformulationthereof.Methods:DT-BSA-NPswerepreparedbydesolvation-chemicalcrosslinkingmethod.ThemorphologyoftheNPswasobservedbyTEM.T
5、hedis-tributionofparticlesizeandZetapotentialoftheNPsweredeterminedbyMalvernparticlesizeanalyzer.TheyieldoftheNPswasquantifiedbyBradfordproteinassaymethod.Theencapsulationeficiencyanddrug-loadingcontentoftheNPswereexaminedbyHPLCmethod.Thepropertyoftheirreleaseinvitrowasinvestigated,basedonthemeasure
6、ofaccumulatedreleaseratioandthefitingofreleasecurve.TheirformulationwasoptimizedbyCentralcompositedesign-ResponsesurfacemethodologyandthedatawereprocessedusingSASstatisticalsoftware.Results:TheoptimizedresultshowedthatDT-BSA-NPsweresphericalwithanaveragediameterof65.3nm,Zetapotentialof-31.4 mV,yield
7、of95.0%,drug-load-2008年第32卷第5期第 224 页224 2008, Vol.32, No.5ProgressinPharmaceuticalSciencesingcontentof4.65%,encapsulationeficiencyof74.3%and24h-accumulatedreleaseratioof74.4%.Conclusion:ThisformulationmethodcouldsignificantlyincreasetheconcentrationofDTinwater.DT-BSA-NPspreparedbythismethodexhibite
8、dasmalparticlesize,highstabilityandsustainedreleaseinvitro.KeywrodsDocetaxel;BSA-NPs;Desolvation-crosslinkingmethod;Releaseinvitro;Centralcompositedesign-Responsesurfacemethodology多西紫杉醇(docetaxel,DT)是由 Sanofi-Aventis公司开发上市的一种新型紫杉烷类抗癌药物,其作用机制是促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚,从而破坏肿瘤细胞的有丝分裂 1 ,用于治疗各种癌症,尤其是晚期乳腺癌和非小细胞癌 2
9、。由于DT在水中的溶解度非常小(约 10 mg/L),因此上市的静脉注射剂泰素帝浓溶液中含有大量的吐温 80,且需用 13%乙醇稀释后方能注射 3 ,由于吐温 80具有溶血性且黏性大,临床实验中大多数患者产生明显的过敏反应 4 ,故近年来开发不含有吐温 80的DT新制剂一直是研究的热点 5。本文以牛血清白蛋白(BSA)作为载体,采用去溶剂化-化学交联法制备DT白蛋白纳米粒(DT-BSA-NPs),成功地提高了DT在水相中的浓度。由于载体 BSA本身具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解及生物相容性好等优点,同时纳米粒(NPs)载体系统具有独特的靶向性、缓释性以及提高药物稳定性、减少毒副作用等特点
10、,尤其当NPs粒径小于 120 nm时具有渗透滞留增强效应(EPR效应) 6, 7,因而 DT-BSA-NPs有望降低泰素帝的毒副作用,减少给药体积,同时靶向肿瘤组织,提高局部药物浓度。Nk4LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司);RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);TK-12B型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司);Zetasizer3000HS激光粒度仪(英国马尔文公司);H-7000型透射电镜(日本日立公司);MK3型全自动酶标仪(美国 ThermoElectron公司);SORVALLT-880型超高速冷冻离心机(美国 KendroLaborato-ry);透析袋
11、(截留分子质量:8 00012 000)。DT(中国药科大学新药研究中心惠赠);BSA(上海昱民生物技术有限公司);考马斯亮兰 G-250试剂盒(南京建成生物工程研究所);25%戊二醛(中国医药集团上海试剂公司);其余试剂均为分析纯。ZET2.1DT-BSA-NPs的制备取处方量BSA溶于水相,置于 30 恒温水浴,以 480 r/min持续搅拌的同时向水相中滴加 DT无水乙醇溶液至处方量,继续滴加无水乙醇至一定比例,加入 2%戊二醛水溶液,继续搅拌固化 24小时,于35 旋转蒸发去除有机溶剂,过 0.22 m微孔滤膜,即得DT-BSA-NPs胶体溶液,冻干后得到红棕色粉末。2.2DT-BSA
12、-NPs的形态、粒径及Zeta电位取优化处方工艺制得的DT-BSA-NPs胶体溶液适量,蒸馏水稀释,磷钨酸负染,透射电镜观察粒子形态(见图 1),马尔文激光粒度仪测定粒径分布(D)及Zeta电位(U)(见图 2)。由图 1可见,NPs呈类球形。由图 2可见,NPs平均粒径为 65.3 nm,Zeta电位为-31.4mV,表明 NPs比较稳定。m1DT-BSA-NPsiv(60 000)(Figure1.TEMphotographofDT-BSA-NPs, 60 000)2008, Vol.32, No.5225ProgressinPharmaceuticalSciences2008年第32卷第
13、5期第 225 页m2DT-BSA-NPssZeta(Figure2.DistributionofparticlesizeandZetapotentialofDT-BSA-NPs)2.3NPs收率的测定方法取 DT-BSA-NPs胶体溶液适量,超高速冷冻离心 1小时(4 , 235 408g),取上清液,蒸馏水稀释适宜倍数,与考马斯亮兰应用液反应 10分钟,酶标仪上于 595 nm处测定吸光度(A595nm),代入标准曲线方程计算得到未去溶剂化的 BSA浓度,再代入公式计算:纳米粒收率(%)=(投入的 BSA总量 -未去溶剂化 BSA量)/投入的 BSA总量100%。2.4DT-BSA-NPs
14、包封率与载药量的测定方法HPLC法色谱条件:色谱柱:Shim-packCLC-ODS(6.0 mm15 mm, 6 m),流动相:甲醇-水(7827),检测波长:229 nm,柱温:40 。在此色谱条件下,以DT峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归,所得标准曲线方程为:A=4404C+390.53(R2=1),可见DT在 0.2 50 mg/L浓度范围内,线性关系良好。取DT-BSA-NPs胶体溶液适量,蒸馏水稀释 4倍,超高速冷冻离心 1小时(4 ,235408g),取上清液 0.1 mL,加入 0.9 mL流动相稀释,进样,HPLC法测定游离DT量。移取DT-BSA-NPs胶体溶液 0.
15、1 mL,加入 1%胃蛋白酶水溶液 1.0 mL, 37 水浴中反应 30分钟,加入 2.9mL甲醇涡旋 2分钟,12000r/min离心10分钟,移取 0.1 mL上清液,用 0.9 mL流动相稀释,HPLC法测定DT总量。将以上所测值代入公式计算:包封率 =(胶体溶液中DT总量 -游离 DT量)/胶体溶液中DT总量100%;载药量=胶体溶液中 DT总量/(DT投入量+载体投入量)100%。2.5DT-BSA-NPs处方工艺的优化考察BSA处方量、DT处方量、乙醇加入量和戊二醛加入量、固化时间、添加剂等因素对DT-BSA-NPs的粒径和包封率等指标均有不同程度的影响。根据预试验对比结果,选择前 3个因素作为优化对象,先进行单因素试验选择适宜水平,然后采用星点设计试验优选处方。2.5.1BSA处方量对DT-BSA-NPs粒径、包封率及载药量的影响BSA处方量对 NPs粒径影响很大,当BSA浓度为 0.01、0.03、0.05、0.10 g/mL时,NPs粒径分别为 193.1、75.3、61.9、79.1 nm,而达 0.15g/mL以上时,其粒径会很大以至出现沉淀。BSA浓度为 0.05g/mL时,NPs包封率和载药量皆最高。2.5.
