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1、1TTV 核酸模板快速制备方法作者：苏明权 ，冯继红 ，于文彬，徐光华 ，马越云，张建芳 ，张林，刘家云 【关键词】 TT 病毒关键词: TT 病毒;聚合酶链反应; 核酸制备 摘 要:目的 寻求建立适合大批量临床标本检测 TT 病毒（TTV ）核酸快速制备方法，直接用于 PCR 扩增. 方法 应用蛋白酶K 裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法，分别制备 TTV 核酸做 PCR模板，用于 TTV 的聚合酶链反应的快速检测 . 结果 在 30 例非甲非庚型肝炎血清和 50 例慢性乙型肝炎患者血清，应用经典的蛋白酶 K 裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分别制备 TTV 核酸模板，在相同条件下进行 PC
2、R 扩增，结果两种制备方法的符合率为 89%. 结论 TTV 是一种新发现的肝炎病毒，目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中 TTV 核酸制备方法，对 TTV 肝炎的快速诊断，具有重要的意义.Rapid preparation of transfusion transmitted virus nucleic acid templateSU Ming-Quan21 ，FENG Ji-Hong2 ，YU Wen-Bin1 ，XU Guang-Hua2 ，MA Yue-Yun1 ，ZHANG Jian-Fang1 ，ZHANG Lin1 ，LIU J
3、ia-Yun11 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xian710033，China ， 2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yanan University，Yanan716000Keywords:transfusion transmitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparationAbstract:AIM To esta
4、blish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template was prepared for PCR using two methods，viz.hydroxybenzene chloro-form extraction and directly rapid cracking.RESULTS DNA 3abstracted by the two methods was amplified at same PCR parame
5、ter and the coincidence rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discovered hepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect its DNA by PCR，so it is very important to establish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.0 引言TT 病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因子时，建立一种敏感
6、、快速、特异的实验室检测方法并评价该病毒因子在肝病中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在临床上应用价值的关键所在.目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中 TTV 核酸制备方法，对 TTV 肝炎的快速诊断，具有重要的意义.我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立一种快速、简便的 TTV 核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意的结果.1 材料和方法1.1 材料 4非甲非庚型肝炎血清 30 例，来自延安大学医学院传染科 ;慢性乙型肝炎患者血清 50 例，来自西京医院就诊患者 ;引物及合成:根据 Nishizawa
7、等 1 报道的引物，外引物:RD037（正义链）5-GCAGCAGCATATGGATATGT-3RD038（反义链）5-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3，扩增片段:270bp;内引物:RD051（正义链）5-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3RD052（反义链）5-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3扩增片段:196bp，由上海博亚生物技术有限公司合成.1.2 方法 蛋白酶 K 裂解酚氯仿抽取法:50L 血清加 200L 裂解液（50mmolL-1 Tris-HCl pH8.0，200mmolL -1 NaCl，10mmolL-1 EDTA，20gL-1 SDS，
8、 1gL-1 蛋白酶 K） ，60 水浴 60min，加等体积酚:氯仿: 异戊醇（25241）混匀，4冰浴下 30min，2000g 离心10min，取上清加等体积预冷无水乙醇 -20过夜，1000g 离心20min，沉淀溶于 20L0.1TE 缓冲液中，备用 .直接快速制备法:20L 血清加 50L 快速裂解液（ 50mmolL-1 Tris HCl，pH8.0 ，50mmolL1 KCl，1.5mmolL-1 MgCl，10gL -1 NP-40，5gL-1 Tween-5205gL-1 Triton X-100，2.0gL-1 SDS）煮沸20min，1000g 离心 10min，取上清
9、做模板.PCR 扩增:第 1 轮PCR 扩增:总反应体积为 25L，包括:10PCR 缓冲液2.5L;4dNTP2.0L;外引物各 1.0L（50pmolL -1 ）;DNA 模板 5.0L;Taq DNA 酶 3UL-1 ;无菌蒸馏水12.5L;无菌石蜡油 30L 覆盖液面，94 变性 3min，进入 PCR 循环，循环条件:9450s，5550s ，7270s，32 个循环，最后72延伸 5min.第 2 轮 PCR 扩增:总反应体积为 25L，包括:10PCR 缓冲液 2.5L;4dNTP2.0L;内引物各1.0L（50pmolL-1 ）;第 1 次 PCR 产物 5.0L;Taq DN
10、A 酶 1.5UL -1 ;无菌蒸馏水 12.5L;无菌石蜡油30L 覆盖液面， 94 变性 3min，进入 PCR 循环，循环条件:9450s，5550s，7270s ，32 个循环，最后 72延伸 5min.产物检测:取 15L 第 2 次 PCR 扩增产物，于 20gL-1 琼脂糖（含 EB）凝胶中，电泳 100V30min，紫外灯下观察结果，出现196bp 片段者为 TTV 阳性.2 结果2.1 30 份非甲非庚型肝炎 2 种 TTV 核酸制备方法检测结果 采用巢式聚合酶链反应（nest-PCR） ，对 2 种方法分别制备6的 TTV 核酸为模板进行扩增，结果在 30 份血清中 2 种
11、制备方法均同时检测出 6 份为 TTV 阳性，二者符合率为 100%.2.2 50 份慢性乙型肝炎 2 种 TTV 核酸制备方法检测结果 采用巢式聚合酶链反应（nest-PCR） ，对 2 种方法分别制备的 TTV 核酸为模板进行扩增，结果在 50 份血清中，蛋白酶 K 裂解酚氯仿抽取法检测出 4 份为 TTV 阳性，快速裂解法检出 5 份为 TTV阳性，二者符合率为 80%.2.3 30 份非甲非庚型肝炎和 50 份慢性乙型肝炎的扩增结果 对 30 份非甲非庚型肝炎患者血清分别制备 TTV 核酸制备方法均同时检测出 6 份为 TTV 阳性，阳性检出率为:20%.对 50 份慢性乙型肝炎 2
12、种 TTV 核酸制备方法检测结果:蛋白酶 K 裂解酚氯仿抽取法检测出 4 份为 TTV 阳性，阳性检出率为 8%，快速裂解法检出 5 份为 TTV 阳性，阳性检出率为 10%. 3 讨论1997 年 Nishizawa 等1 从不明原因的肝炎患者血清中7及肝组织中检出一种新的肝炎病毒，命名为 TT 病毒（transfusion transmitted virus， TTV） ，是一单链、无包膜的 DNA 病毒，并认为该病毒与转氨酶升高密切相关，可能是病因不明肝炎的致病因子.当一种新的病原体发现时，在研究其致病性的同时，实验室检测方法的研究是十分重要的，在实验室诊断方法的建立上，方法学的临床可行
13、性和适用性是临床应用的关键，由于临床检测标本量大，标本来源复杂，所以，即考虑到方法的可靠性，又要考虑到临床适用性，才能更好地为临床提供准确的诊断依据.我们对 30 份非甲非庚型肝炎和 50 份慢性乙型肝炎，采用 2 种 TTV 核酸制备方法进行检测，其结果二者符合率分别为 100%和 80%，总符合率为:89%.Kanda 等2 对 TTV 感染进行流行病学调查研究，发现TTV 在各种肝病中的感染率达 43%47%.而我国学者巍来等 3 对不同慢性肝炎患者血清中 TTV 检测，其阳性率，慢性乙型肝炎为:7%;慢性丙性肝炎为 29%;慢性非甲庚型肝炎为 34%;傅恩清等4 对西安地区病毒性肝炎患
14、者 TTV DNA 的检测，其感染率高达 60%.我们对 30 份非甲非庚型肝炎患者血清分别制备 TTV核酸制备方法均同时检测出 6 份为 TTV 阳性，阳性检出率为:20%.对 50 份慢性乙型肝炎 2 种 TTV 核酸制备方法检测结果: 蛋白酶 K 裂解酚氯仿抽取法检测出 4 份为 TTV 阳性，阳性检出率为 8%，快速裂解法检出 5 份为 TTV 阳性，阳性检出率为:10%.在对 1 例蛋白酶K 裂解酚氯仿抽提法阴性而快速裂解法阳性的扩增产物，进行测序结果证实为 TTV 引物所扩增的目的片段， 1 例蛋白酶 K 裂解酚氯仿8抽提法扩增阴性结果可能是由于在抽提过程中造成丢失而导致，而快速裂
15、解法不需抽提等步骤，直接用于扩增从而减少核酸的丢失.目前，对 TTV 的研究仅对基因组有一定的了解，尚缺乏建立抗原、抗体检测方法的条件，所以对 TTV 核酸检测就成为目前唯一的证实病原体存在的方法，建立一个敏感、快速、简便、特异的基因检测方法，首要的问题就是解决临床标本中病原体核酸的有效制备，获得充分的目的靶基因，以确保方法学建立的可靠性和适用性.我们研制的 TTV 核酸模板快速制备方法，即充分考虑到方法的可靠性和稳定性，又具有快速、简便等特点，可为临床大批量标本的筛选检查提供了条件. 参考文献:1Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，Yoshizawa H，Miya
16、kawa Y，Mayumi M.A novel DNA virus（TTV ）associated with ele-vated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of un-known etiology J.Biochem Biophys Res Commun，1997;241（1）:92-97. 2Kanda T， Yokosuka O，Ikeuchi T.The role TT virus infection in viral hepatitis J .Hepatology，1999;29 （6 ）:91905-1908. 3Wei L，Tao QM，Pan XC，Zhang YC，Chang JH，Wu WY，Li KJ.Detection of
