《p15mRNA在肺癌组织中的表达及其意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《p15mRNA在肺癌组织中的表达及其意义（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1p15mRNA 在肺癌组织中的表达及其意义作者：戚好文，郝光辉，李焕章 【关键词】 肺肿瘤 关键词: p15 基因; 肺肿瘤;原位杂交 摘 要: 目的 研究抑癌基因 p15mRNA 在肺癌组织中的表达，揭示 p15 基因的失活与肺癌的发生和其组织类型的相关性. 方法 对病理确诊的 93（非小细胞肺癌 65，小细胞肺癌 28）例肺癌病理组织切片，采用 p15cDNA 探针以原位杂交组织化学方法检测p15mRNA 在肺癌组织中的表达水平 . 结果 p15mRNA 阳性表达于肺癌组织细胞质或细胞核中，在细胞质中可见到较多的棕黄色颗粒，而细胞核内棕黄色颗粒相对少见.p15mRNA 的阳性表达率: 非
2、小细胞肺癌为 46%（30/65） ，其中鳞癌 46%（23/50） ，腺癌47%（7/15）.小细胞肺癌 20%（5/25 ）. 非小细胞肺癌 p15mRNA阳性表达率高于小细胞肺癌;高分化的鳞、腺癌阳性表达率高于同组中的低分化的鳞、腺癌（P0.05 ）. 结论 p15 基因的失活与肺癌的发生密切相关，而且其失活程度与肺癌组织类型的恶性程度呈负相关. Keywords:p15gene;lung neoplasms;in situ 2hybridization Abstract:AIM To show the association of inactivation of p15gene in
3、lung cancers with pathogenesis and variation of lung cancer tissues by studying the expression of p15mRNA in lung cancers.METHODS There were93cases，of which65were NSCLC and28were SCLC，confirmed by pathologi-caly.The expression of p15mRNA in pathological sections of lung cancer was examined using p15
4、cDNA and in situ hy-hyidizatino-histochemistry method.RESULTS In93lungcancers， positive expression of p15mRNA was found located in the cytoplasm or nuclei，with quite a lot of brown-yellow granules seen in cytoplasm，but only a few in nuclei.In NSCLC cases the positive rate of p15mRNA expression was46
5、%（30/65） ，of which，lung squamous carcinoma and lung adenocarcinoma were46%（23/50 ）and47% （7/15 ）respec-tively，and the positive rate in SCLC cases was20%（5/25）.The positive rate of p15mRNA expression was higher in NSCLC than in SCLC（P0.05）.The positive rate in well-differentiated lung squamous carain
6、omas and lung adeno-carainomas was higher than that in poorly differentiated ones（P0.05 ）.CONCLUSION The results 3showed that p15inactivation might be strongly related to pathogenesis of lung cancers and the degree of p15inactivation might be negatively associated with the malignant degree of the lu
7、ng cancer tis-sues. 0 引言 探讨抑癌基因的失活在肺癌发病机制中的作用是目前研究中的一个热点，抑癌基因 p15/MTS2（简称 p15 基因） 1 编码p15 蛋白属于 INK4 蛋白家族，它作用于细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）与细胞周期蛋白（cyclin）复合物，特异性抑制 CDK4 及CDK16 激酶活性，阻止其磷酸化 R6 蛋白，限制细胞由 G1 期向 S期转变，减少细胞增殖.以前我们2 应用免疫组织化学方法证实了 p15 蛋白与肺癌的相关性. 现运用 mRNA 原位杂交方法检测p15mRNA 在肺癌组织中的表达水平，以进一步认识 p15 基因与肺癌之间的关系. 1
8、材料和方法 1.1 材料 病理标本来源为西京医院病理科 1997-01/1998-02 原发性支气管肺癌患者手术或纤维支气管镜活检组织检查标本，共计 93 例，均经 40gL-1 多聚甲醛固定及石蜡包埋、4HE 染色、光镜观察证实. 根据 1997 年世界卫生组织肺癌分类标准进行组织学分类:非小细胞肺癌（NSCLC 即鳞癌加腺癌）65 例，其中肺鳞癌 50（高分化 10，中分化 29，低分化 11）例，肺腺癌15（高分化 3，中分化 9，低分化 3）例.小细胞肺癌（ SCLC）28例.p15 基因 cDNA 探针，原位杂交组织化学试剂盒，DAB 试剂盒及 APES 试剂均购自武汉博士德生物工程
9、有限公司. 1.2 方法 肺癌组织病理切片经二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水 .静置于新鲜配置 30mLL-1 的 H2 O2 溶液中（室温 24 ，10min）以灭活组织切片中内源性过氧化氢酶.加入 11000 比例稀释蛋白酶 K，切片置于 3715min 以暴露 mRNA 核酸片段. 含地高辛标记 p15cDNA 探针的杂交液于 9095水浴 10min 后置于碎冰 3min.滴加 10L 冷却 p15mRNA 原位杂交液干切片，37 恒温杂交 20h.滴加 5gL-1 BSA 液，24 封闭 20min，加入 1500 小鼠抗地高辛抗体，25孵育 30min 后洗涤，加1100 生物素化山羊抗小鼠
10、 IgG，25 静置 20min 后，洗涤，加SABC 复合物，25静置 20min.DAB 显色，苏木精复染，常规脱水透明后以中性树胶封片. 1.3 原位杂交组织化学染色对照及阳性结果判断以博士德公司提供的已知 p15mRNA 原位杂交阳性染色的膀胱肿瘤组织切片作为阳性对照.以 0.5molL-1 ，pH7.4 的 PBS 液代替含有5p15cDNA 探针的原位杂交液作为阴性对照. 以肿瘤细胞质中出现棕黄色颗粒状染色为阳性染色细胞.选取 5个高倍视野（400）肿瘤组织细胞，确认视野中无阳性染色的正常组织细胞，平均每视野阳性细胞计数占肿瘤细胞总数 5%以上为阳性染色，余为阴性染色.盲法观察切片
11、染色结果，计算阳性染色例数. 统计学处理: 采用四格表资料及 2K 表资料的 2 检验方法进行统计学分析. 2 结果 2.1 肺癌组织病理切片中染色情况 p15mRNA 表达阳性的肿瘤细胞质中可见到大量的棕黄色染色颗粒，而细胞核内棕黄色颗粒相对少见（Fig1AC）. 图 1 略 2.2 原位杂交检测结果 不同组织类型肺癌 p15mRNA 阳性表达率:NSCLC 为 46%（30/65） ，其中鳞癌 46%（23/50 ） ，腺癌47%（7/15）;SCLC 为 20%（5/25）.NSCLC p15mRNA 阳性表达率与 SCLC 阳性表达率进行比较，2 =5.0875，P0.05，无显著差异
12、. 2.3 不同分化程度的肺鳞癌及肺腺癌 p15mRNA 表达 肺鳞癌 50 例，其中高分化、中分化及低分化分别为 8，28 及 10 例，而相应 p15mRNA 阳性表达例数分别为 6，13 及 2 例. 肺腺癌 15 例，其中高分化、中分化及低分化分别为 3，9 及 3 例，而相应p15mR-NA 阳性表达例数分别为 3，5 及 0 例.肺癌恶性程度的高低一般根据肺癌的类型和分化程度来化分，按类型区分是小细胞肺癌腺癌鳞癌;按细胞分化程度区分，是低分化高分化.本研究 p15mRNA 表达结果也证实了恶性程度越高，其 p15mRNA阳性表达率越低;恶性程度越低，p15mRNA 阳性表达率也越高
13、，如小细胞肺癌和低分化的鳞、腺癌.总之 p15mRNA 表达与肺癌的恶性程度呈负相关. 3 讨论 p15 基因又称多肿瘤抑制基因 MTS2，定位于人染色体9p21 所编码的 p15 蛋白为细胞周期蛋白 D/CDK 激酶的抑制因子1 .有研究表明 p15 基因及其表达产物在人类多种原发性肿瘤组织及细胞株中发生改变，如白血病、恶性神经胶质细胞瘤、肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、非何杰金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞瘤、胆囊癌等均有 p15 基因的异常3-5 .可见 p15 基因在限制肿瘤发生发展、调节细胞生长方面发挥着重要的作用. 7我们曾通过免疫组织化学方法证实了肺癌与 p15 基因的相关性2 ，即 p15 蛋
14、白在小细胞肺癌、NSCLC 中都有表达，而且p15 蛋白在 NSCLC 的表达高于小细胞肺癌，高分化鳞、腺癌的表达高于低分化的鳞、腺癌.现通过 mRNA 原位杂交方法同样证明了p15mRNA 与肺癌及其组织类型的相关性，虽研究方法不同，所得结果与既往的研究一致，表明 p15 基因的失活在肺癌的发生发展中起着重要的作用.这与国外一些学者的研究类似 6 . 目前研究发现 p15 基因失活的机制是纯合子缺失或 p15 基因的过度甲基化，但通过对多种肿瘤细胞研究发现 p15 基因的缺失是其失活的主要机制7-9 .p15 基因常因转录区域 5-CpG 岛多位点过度甲基化而被失活10 .CpG 岛是 DN
15、A 的一段区域，长度约 0.52.0kb，富含 GC.在正常组织中没有甲基化 .肿瘤抑制基因起动区域正常的未被甲其化的 CpG 岛的过度甲基化与转录丢失有关. 这种异常过度甲基化在染色体的广阔区域都能出现，诸如在 11P就可以看到.这种基因的过度甲基化具有选择性，视肿瘤类型而定.在一些神经胶质瘤和白血病中，这种机制似乎只选择性涉及到 p15 基因.p15 是过度甲基化灭活的候选基因.因为 p15 外显子周围 760 个核苷段区域含有大量的对甲基化敏感的限制性核酸内切酶位点，在识别序列中有 CpG 二核苷酸. 8p15 基因是细胞周期相关基因，抑制细胞增殖，阻断细胞生长于G1 期 .抑制肿瘤的发
16、生.为此，目前通过大量的动物肺癌实验模型研究证实，p15 基因的失活在诱发肺癌的发生过程中也起着重要的作用11，12 ，这进一步说明了 p15 基因与人类肺癌发生的相关性.p15 基因作为一种新的候选肿瘤抑制基因，人们对它的研究才刚刚开始.很多问题需要进一步深入研究，如 p15 在体内作为生长调节因子的功 能，p15 在肿瘤抑制途径中的功能等.p15 基因的发现弄清了肿瘤增殖机制中的一部分过程.由于 p15 比 p53 小，易于校定，所以可成为比 p53 有力的基因治疗的候补者. 参考文献: 1Hannon GJ，beach D.15INK4B is a potential effector of TGF-beta-induced cell cycle arrest J .
