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1、1HCV 包膜蛋白的免疫与疫苗研究进展关键词：HCV 包膜蛋白免疫疫苗 摘要近年来使用得组蛋白及合成肽的研究表明，在 HCV膜区存在多个 B 细胞表位，抗外膜蛋白抗体的检出率高度依赖于抗原获得的方法、不同的感染阶段以及检测模式，随着噬菌体呈现技术、转细胞技术、核酸免疫技术等用于 HCV 感染的致病机理及疫苗研究，对进一步完善和发展有较 HCV 疫苗提供了新的途径。 丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子，虽然通过对献血者进行抗-HCV 的筛选使输血后 HCV 的感染率得到了显著的降低，但在高危人群中仍存在社区获得性的 HCV 感染，目前全世界约有 1.7
2、亿 HCV 感染者,其中约有 50%急性感染者转变为慢性,进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌.HCV 感染后缺乏有效的保护性免疫。可能的原因是：（1）HCV 高度变异，逃避机体的免疫清除；（2）HCV 在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；（3）病毒颗粒与低密度脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；（4）外周血淋巴细胞可能有 HCV 储存库的作用 1，对 HCV 感染目前还有一种有效的治疗手段，慢性 HCV 感染者对- 干扰素的反应可低至215%25%，其它抗病毒核酸类似物的效果甚微，因此，需要提高治疗手段及发展有效的疫苗以控制 HCV 感染。HCV 的包膜蛋白是宿主攻
3、击的主要目标，一直都是 HCV 疫苗研制的首选抗原。本文概述了近年来对 HCV 包膜蛋白的体液免疫及疫苗研究等方面的进展。 1HCV 包膜糖蛋白的结构特征 HCV 属于黄病毒家族的一员，其基因组全长约 9.4kb，编码30103033 个氨基酸的多蛋白前体，结构蛋白（核心蛋白 C，包膜蛋白 E1 和 E2）在宿主内质网中信号肽酶的作用下2 ，3，裂解出包膜蛋白 E1 和 E2 对应的氨基酸位置分别为E1：192383；E2：384 809。E1 糖蛋白是一个约 3035kD的糖基化蛋白，含 N-糖基化位点 56 个，脱糖基后为 21kD。E2糖蛋白含糖基化位点约 11 个，其糖蛋白的分子量为5
4、8kD70kD，在内源性糖基化酶的作用下，得 36kD40kD 的脱糖基蛋白4。目前的研究表明，HCVe1 、E2 蛋白通过非共价键相连形成异源二聚体，代表了 HCV 包膜糖蛋白的天然构象。E2 的 N端为高变区（HVR ） ，HVR1 位于氨基酸的 384411，日本学者的研究显示，在 474480 位存在第二个高变区（HVR2） ，但对它的研究相对较少。 2HCV 包膜糖蛋白的体液免疫 2.1HCV 外膜区 B 细胞表位。病毒的包膜蛋白对于宿主产生体液免疫反应很重要，因为宿主首先接触的是包膜蛋白，而且这些蛋白的表达水平较高；宿主的保护性免疫常依赖于针对病毒表面蛋3白的抗体，该抗体能阻断病毒
5、与敏感细胞的结合，也可能通过加强细胞免疫清除病毒，因此，研究针对 HCV 包膜蛋白的体液免疫具有重要意义。HCV 感染后血清中病毒含量极低，同时目前缺乏有效的体外培养系统及合适的动物模型繁殖病毒，无法获得大量的天然病毒抗原，目前只能通过合成肽或基因重组的方法，获得 HCV 包膜蛋白抗原，用于研究 HCV 感染者中针对 HCV 包膜蛋白的免疫特征。 根据外膜区推测的相应氨基酸序列，合成一系列相互重叠的多肽作为抗原，可对外膜区的抗原表位进行定位。Ray 的研究表明，在 E1 区存在两段潜在的表位，P1：210223 ，P2 ：315327，P1 位于变异较大的区哉，P2 位于高度保守的区哉，在 3
6、8 份感染者血清标本中，有 35 份（92%）与 P2 反应，仅 17 份（44.7% ）与 P1 反应5。Jackson 等的研究认为，代表 E1、E2 非高变区肽 20 段中仅 1 段与 45 份抗-HCV（+）血浆标本有明显的反应，而代表高变区的 24 个肽中有18 个与抗-HCV（+）的血浆标本反应，且 40%的血标本与两个以上的肽起反应，其中有的肽段的差异达 50%以上，有两份血标本与7 个不同的肽序列有交叉反应，结果表明，许多抗-HCV （+）的标本中有广泛的抗高变区抗体存在，可能这些抗体限制了高变区序列的变异6。多数研究认为在 HVR1 存在中和性的抗原表位，而在HVR2 则没有
7、，目前认为，HVR1 的 B 细胞表位包括：400 409aa7、398410aa8以及 399405aa9。 这种使用合成肽鉴定表位的技术也存在一些问题。首先，合4成肽只能反映线性表位，而忽视了外膜糖蛋白中的许多构象型表位。其次，鉴定出的表位能否在体外诱导中和性抗体，在体内产生保护作用还有待进一步研究。 2.2HCV 抗外膜蛋白抗体的检出及意义。使用 HCV 重组外膜蛋白作为抗原检测 HCV 感染者中抗外膜蛋白的抗体，其检出率在不同研究者中的差异很大。多方面的因素影响抗外膜蛋白的检出。首先，抗外膜蛋白抗体的检出高度依赖于抗原产生的方法。使用来自E.coli 的 E2 的融合蛋白作为抗原，在
8、HCV 感染者中的检出率低至20%。而使用糖基化形式外膜蛋白作为抗原，在 HCVrNA 阳性慢性携带者中抗体的检出率可达 97%10。在缺乏 E2 的情况下，针对重组 E1 的反应较低，Kohara 用痘苗病毒表达的 E1（gp35）作为抗原，仅在少许 NANBH 患者（7%23%）的血清中检测到抗体，尽管在这些患者中抗-核心、抗-NS3 的抗体检测可高达90%95%11 。目前对 HCV 外膜蛋白的结构研究表明，E1 的正确折叠和抗原性依赖于 E2，这可解释重组 E1 在缺乏 E2 时的微弱免疫反应，表明 E1 和 E2 均是 HCV 疫苗必不可少的成分。因此，将E1、E2 在合适的表达系统
9、中共表达，获得具有与天然构象相似的膜抗原，对于发展有效的疫苗是有帮助的。其次，抗外膜蛋白抗体的检出率与 HCV 感染的不同阶段密切相关。慢性 HCV 感染者的检出率较急性者为高，而且，在慢性感染的不同阶段，针对 HCV 蛋白的抗体都能检测到，说明针对 HCV 外膜蛋白的反应在肝炎起始后即已开始，并在疾病的慢性阶段进一步发展。最后，使用的实验方法也5显著影响抗外膜蛋白抗体的检出，以 WB（Western-Blot）模式分析蛋白使构象性表位破坏，抗体检出率较低，而用免疫荧光、免疫沉淀、ELISA 等方法对蛋白构象的破坏较小，因而检出率较高。 目前检测到的抗包膜蛋白抗体的意义还不是很清楚，抗外膜蛋白
10、抗体的检出伴随病毒血症同时出现说明该抗体对于病毒的清除不是完全必要的，大多数抗包膜蛋白抗体是非中和性抗体。而有研究表明针对 E2hVR1C 末端 1427aa 的抗体可使相应的相似株减少或消失，该抗体也可阻止病毒粘附于细胞。在 E2 的 HVR1 区中存在中和抗体，HVR1 区是显露的且形成 B 细胞表位7，与 HIV-1的外膜蛋白 gp120 的 V3 环同源，易于介导较强的免疫反应。 HCV在宿主的免疫选择作用下，形成 HVR1 区基因的高度变异，以逃避免疫监视。HCV 的高度变异成为 HCV 疫苗研制的首要难题。除HVR1 区外。目前认为在外膜区其它部位也存在中和表位。而且有可能目前检测
11、到的抗体大都为针对线性表位的抗体，不具保护作用，而针对构象型表位的抗体，则可能产生保护性免疫，由于我们常规的筛选方法使用的是变性的 HCV 外膜蛋白，不能检测到此种抗体，无法确立该抗体与 HCV 转归的关系。因此，获得天然膜蛋白，对于发展灵敏的诊断实验和疫苗研究均有帮助。 3HCV 外膜糖蛋白与疫苗研究 HCV 外膜蛋白为 HCV 疫苗研制的首选抗原。以 HCV 外膜区基因为基础的疫苗首先必须解决其变异问题。Cloo 等用 Hela 细胞表达的重组 HCVe1/E2 免疫黑猩猩后，用 10CID 的同型病毒攻6击，结果 7 只中有 5 只受到了保护，而对照组则发生急、慢性感染，结果表明 HCV
12、 的外膜抗体具有一定的中和能力。但这种保护是“单特异性”的，仅对同型病毒的再感染有保护作用12。这是由 HCV的基因变异决定的，HCV 不仅存在多种基因型和亚型，在同一个体中，也包含多个相似株（quasispecis） ，在感染的不同阶段，相似株也发生变异。针对 HCV 的混合抗体或许对清除感染有用。最近，Puntoriero 根据 200 份不同的 HCV 分离株的 E2hVR1 序列，构建了 HVR1 噬菌体肽库，从中筛选出能和较多血清发生反应的噬菌肽，用这些肽去免疫动物，产生的抗血清可以和 90%以上不同的 HVR1合成肽发生交叉反应，用这种多条噬菌体作为抗原可以解决 HCV 膜区基因高
13、变问题。但是，该研究中使用的抗原仍然是合成肽，并且其在动物实验中的保护作用还有待进一步研究13。 其次，以 HCV 外膜区为基础的疫苗的另一个难题是膜区蛋白的来源问题，通过体外表达获得足量具有天然构象或与天然构象类似的蛋白是 HCV 疫苗新的来源。最近，Baumert 等构建了只含HCV 结构基因（即 HCV/C、E1 和 E2）的杆状病毒表达质粒，在该质粒转染的相同，颗粒含有部分 HCVrNA，说明没有非结构区，没有 HCV 本身的 RNA 聚合酶，同样可以完成病毒 RNA 的复制和病毒包装14 。这就为体外获得具有天然构象的 HCV 膜抗原提供了一条途径，为 HCV 的疫苗研究奠定了基础。
14、Lagging 将 HCV 膜基因，即 HCVe1（ 174359）和 E2（371 742）基因连接在疱疹性口炎病毒（VSV）G 蛋白跨膜内区基因相连，这样在 E1、E2 的 C 端7提供了一个能在膜上锚定的信号，可使镶嵌蛋白在细胞的膜表面得到表达，采用 VSV 的温敏株（ ts045）以及在不能耐受（ 40.5）条件下培养.转基因细胞则可产生 VSV/HCV 假病毒颗粒,该假病毒颗粒具有再感染哺乳动物细胞的能力,用同型 E 抗原免疫黑猩猩所获得的免疫血清可抑制 VSV/HCV 假病毒绵感染性 15,充分表明 HCV外膜抗原可用于免疫研究获得中和性抗体,同时,在体外表达系统中可以获得具有结构
15、、功能与天然病毒相似的膜蛋白，该蛋白中含有的构象表位产生的抗体，可能具有保护作用。 近年来，核酸疫苗技术的出现，为丙型肝炎的防治提供了一个新的机遇。DNA 疫苗是直接将含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA 注入体内，经 T 细胞摄取、转录、翻译、表达出相应抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答，在 HCV 防治中，核酸疫苗与传统的重组疫苗及肽疫苗相比，具有多方面的优势：（1）基因免疫具有交叉保护作用，有利于克服 HCV 外膜基因的高变性给疫苗研制带来了困难。 （2）核酸免疫的抗原多肽的提呈过程与自然感染时相似，直接将具有天然构象的蛋白呈递给免疫系统，不会造成构象性表位的改变或
16、丢失；（3）基因免疫同时诱发机体的体液免疫与细胞免疫，效果更好。 以含有 HCV 外膜基因为基础的核酸免疫，现在已进行了多方面的尝试。Lee 等构建了不同的含有 HCV/E1 基因的表达质粒，其中包括含有质粒-单细胞集落刺激因子（GM-CSF）的融合基因质粒。结果表明，含有 GM-CSF 的融合质粒与只有包膜区基因的质粒8相比，诱导的抗体反应和淋巴细胞增殖反应均大大增强，用双顺反子质粒使 HCV/E 和 GM-CSF 同时表达，获得最佳免疫效果。同时，产生的强烈的体液免疫反应，除了可产生针对相同基因型病毒膜抗原的 HVR1 的抗体反应上，还可产生针对异型病毒 HVR1 的抗体16。Nakano 等的研究也证实以 la 型的 E2 区构建的质粒进行基因免疫产生的抗体也可同 lb 型 E2 区抗原发生反应17。有研究表明，经 DNA 免疫的小鼠产生针对 HVR1 的交叉反应性抗体识别的位点主要位于 HVR
