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1、1Delta 模块 HLA 配型检测方法的建立作者：吕沁风，章伟，朱发明，严力行【摘要 】 为了建立 delta 模块配型的检测方法，采用盐析法提取DNA，PCR 技术扩增 delta 模块，GeneScan 模式检测 PCR 产物。结果表明，在 104 份随机样本中，PCR 扩增出的 delta 模块具有高度多态性。DNA 片段长度范围在 81-393 bp，片段数目为 6-32个；片段长度集中在 81-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp 4 个区域。结论： 建立的 delta 模块配型技术是可行的，可以用于造血干细胞移植供者的筛选。首次获得了中国
2、汉族人群 delta 模块的数据资料。 【关键词】 delta 模块Establishment of Delta Block Matching TechniqueAbstract To establish delta block HLA-matching technique，DNA was extracted from whole blood by salting-out method，delta block was amplified by polymerase chain reaction (PCR)，and PCR product was detected by 2GeneScan.Th
3、e results showed that delta block had polymorphism in 104 samples without sibship of the Han people from Zhejiang province.The range of DNA fragment length was 81-393 bp and could be divided into 4 groups: 81-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp.The numbers of DNA fragments were 6-32. It is concl
4、uded that the method of delta block matching is reliable and can be applied to select donors for the patients to be transplanted.It is the first time to get delta block data of the Han people in China.Key words delta block; delta block matching; HLA-matching technique; block matching模块配型技术（block mat
5、ching）在造血干细胞移植中具有一定的意义。Witt 等1研究发现，造血干细胞移植供受者HLA-A、B 和 DRB 6 个位点相合时，受移植病人主要组织相容性复合物（MHC）中的非 HLA 标记与供者相合可以提高存活率，减少急性 GVHD 的发生，这种非 HLA 标记的检测技术被称为模块配型。MHC 模块包括 alpha、beta、gamma、delta 4 个模块，delta 模块配型是检测 HLA-DR 和 DQ 周围的序列。 国外对 beta 和 delta模块配型技术进行了一些研究，但是国内研究较少。参照有关文献31 ，我们建立了 delta 模块配型技术，并对汉族人群样本进行了分析
6、，现将结果报告如下。材料和方法样本来源随机选取 104 例浙江汉族非血缘关系的人群，抽取全血，EDTA 抗凝待用。23 对亲缘关系的 HLA-A、-B、-DRB 6 位点相合的造血干细胞供、受者和 26 对非亲缘关系的 HLA-A、-B、-DRB 6 位点相合造血干细胞供、受者，均来自本中心进行 HLA 配型的患者和供者。仪器与试剂MJ-240 型 DNA 扩增仪（美国 MJ 公司产品） ； PCR 缓冲液（10buffer） 、10dNTP、MgCl2、Taq DNA 聚合酶（Roche公司产品） 。引物参照文献1 设计，delta-F 为 HEX-5 4GATAGAGAGGATTCTAAA
7、TG 3 ； delta-R 为 5 TGGAACAGCCAGAAGGAC 3，其中 delta-F 引物 5 端标记荧光基团 HEX。引物由上海基康生物技术公司合成。DNA 抽提方法按快速盐析法2 。PCR 扩增PCR 扩增体系总反应体积为 10 l，其中含 10PCR buffer 1.0 l，样本DNA 1.0 l，Taq DNA 聚合酶 0.4 U；dNTP、MgCl2 终浓度分别为 0.2 mmol/L 和 2.0 mmol/L，特异性引物终浓度为 0.5 mol/L。PCR 扩增参数 扩增参数为：95预变性 5 分钟，95变性 30秒，48退火 30 秒，72延伸 30 秒，35
8、个循环，冷却至 4。产物检测以 ROX500 作为分子内标，取产物 0.5 l 与上样缓冲液 1 l5混合，95热变性 3 分钟后速冷，上 ABI PRISM 377 测序仪以基因扫描（GeneScan）模式进行 PAGE 电泳，采用 Genetype 软件进行数据分析。结 果delta 模块扩增每个样本扩增出不同数目和不同长度的 DNA 片段。样本扩增出的 DNA 片段个数为 6-32 个（附表） ，长度在 81-393 bp 之间。这些片段构成每个样本各自独特的基因型（附图） 。delta 模块 DNA 片段长度分布delta 模块扩增出 DNA 片段长度大小不一，相对较为集中分布在 81
9、-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp 4个区域。其中每个样本有固定的峰：81 bp，91 bp 和 163 bp。delta 模块检测的重复性从这些样本中随机选取 10 个，重复相同的条件 3 次，每个样本每次均得到相同数目和长度的片段，说明该方法有良好的重复性。Table.Distribution of delta block in the Han people（略）6造血干细胞移植供受者 delta 模块配型相合情况23 对亲缘关系供受者中有 22 对供受者 Delta 模块相合，1对 delta 模块不同。26 对非亲缘关系的造血干细胞供受者中
10、，6 对delta 模块相合，20 对 delta 模块不同。讨 论造血干细胞移植是治疗白血病、重症再生障碍性贫血等疾病的重要手段，大部分病人需寻找无血缘关系的 HLA 位点相合的供者。国外的研究报道，大约有 30的患者可能找到亲缘关系的供者，而70的病人则需要寻找非亲缘关系的供者。研究表明，在供受者HLA-A、-B、-DRB 6 位点相合的情况下，亲缘关系供者比非亲缘关系供者的效果要好，推测 MHC 模块是否相合可能是其中的原因之一。近年来，一些研究者关注非 HLA 区域在移植中的作用，如杀伤性细胞免疫球蛋白受体（KIR）基因和细胞因子基因的多态性、MHC 模块等。Trimboli 等3 发
11、现，供、受者 HLA-A，-B，-DRB 6 位点相合的移植病人，在供、受者 beta 和 delta 模块相合的情况下，急性 GVHD 的发生率和程度比 beta 模块和（或）delta模块不合的病人显著降低，这表明供、受者 delta 模块相合可能会降低 GVHD 的发生，因此在 HLA 位点配型的基础上，检测供受者7delta 模块是否相合对于造血干细胞移植供者的选择具有一定的参考意义。MHC 模块包括 alpha、beta、gamma 、delta 4 个模块，每个模块是研究特定 HLA 基因周围相关的序列，这些非 HLA 序列呈现高度的多态性，包含双核苷酸重复序列。检测模块的每条引物
12、在该模块中有 2-3 个特定的结合位点，重复序列的拷贝数目和引物位置的微小变化都会引起模块检测结果的变化，因此随机人群的模块配型结果都不相同。其中 delta 模块是研究 HLA-DR 和 DQ 周围的序列，与 HLA-DRB1 的第 2 外显子有密切的关系 4，5 。早期Delta 模块检测方法常为普通 PCR 扩增后进行电泳和扫描，得出PCR 产物分布的密度和几何强度，然后再扫描分析。该方法灵敏度不高，分辨能力不强，检测的结果为双链 DNA 的结果。本实验中我们改进了 delta 模块的配型技术，首次采用 HEX 荧光基团作为标记物，并在 ABI PRISM 377 测序仪上用 GeneS
13、can 模式，检测单链 DNA，结果是该法大大提高了 delta 模块检测的灵敏度和精确性，而且具有很好的重复性，为 delta 模块的检测提供了一种可行的方法，这将有利于进一步阐明造血干细胞移植与 delta 模块的关系。在本实验中我们利用建立的 delta 模块配型技术检测了部分汉族人群样本，首次获得了中国汉族人群 delta 模块的数据资料。结果提示，人群中的 delta 模块呈现高度多态性。虽然 Witt 等1 首8先报道 delta 模块配型相合有利于移植后患者的存活，其实验室也一直在完善方法，但是由于其所获得的数据有限，而且由于建立的方法实验要求较高，操作比较复杂，尚未被大多数实验
14、室所接受，在造血干细胞移植配型中也没有被广泛采用，看来，在这方面尚需要积累一定的数据。本实验中我们用 GeneScan 技术检测了部分造血干细胞供受者的 delta 模块相合情况，简化了 delta 模块配型技术，便于实验操作，但 delta 模块相合程度与临床移植后的关系仍需积累资料，以便进一步分析。【参考文献】1 Witt C， Sayer D，Trimboli F，et al. Unrelated donors selected prospectively by block-matching have superior bone marrow transplant outcome.Hum
15、 Immunol，2000; 61: 85-912 朱发明，傅启华，金蕾等.PCR-SSP 法检测A1，2BO1 ，2 血型基因型.临床检验杂志，2000； 18:267-2693 Trimboli F，Witt C，Sayer D，et al. Matching of non-HLA sequences in the MHC may improve survival outcome in 9HLA matched unrelated bone marrow transplanted recipients.13th IHWS Transplantation of Hematopoietic Stem Cells Joint Report.2002; L20JR335:1-44 Tay GK，Witt CS，Christiansen FT，et al. The identification of MHC identical siblings without HLA typing.Exper Hematol，1995;23:1655-1665 Ketheesan N，Gaudieri S，Witt CS，et al. Reconstruction of the block matching profiles.Hum Immunol，1999; 60: 171-176
