《Celecoxib通过抑制Survivin表达促进肺癌A549细胞凋亡》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Celecoxib通过抑制Survivin表达促进肺癌A549细胞凋亡（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Celecoxib 通过抑制 Survivin 表达促进肺癌 A549细胞凋亡【摘要 】 目的研究 Celecoxib 对肺癌 A549 细胞生长和凋亡的影响并探讨其作用机制。 方法用 Western blot 法检测Celecoxib 抑制肺癌 A549 细胞后生存素（Survivin）表达的变化；用酶联免疫吸附法（ELISA ）测定培养上清液中前列腺素2（prostaglandin-2，PGE2）含量的变化；用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。 结果 随着Celecoxib 剂量的增加和时间的延长， PGE2 的含量减少，survivin表达也相应减少，细胞增殖
2、减少而凋亡增加。 结论Celecoxib 可以通过 PGE2 的途径下调 A549 细胞 survivin 的表达并促进细胞凋亡。 【关键词】 A549 细胞Celecoxib前列腺素 2环氧合酶 2生存素Celecoxib Promote Apoptosis in Human Lung Cancer A549 Cells by Inhibiting SurvivinAbstract： Purpose To investigate the effect and 2mechanism of Celecoxib in inducing proliferation inhibition and ap
3、optosis in human lung cancer A549 cells.Methods The expression of survivin through Celecoxib blockading were detected by Western Blot. ELISA were used to detect the change of prostaglandin-2 (PGE2) content in the supernatant of culture solution. The anti-proliferative effect was measured by using Me
4、thabenzthiazuron (MTT) assay. Cell cycle and apoptosis were analyzed by using flow cytometry. Results With the blockade of Celecoxib increased, the PGE2 content reduced and the expression of survivin weakened, but the apoptosis rised. Conclusion Celecoxib can down-regulate the expression of survivin
5、 and then promote the apoptosis of A549 cells via PGE2 pathway.Key words: A549 cell; Celecoxib; PGE2; COX-2; survivinCelecoxib 是 COX-2 的特异性抑制剂，最初用于治疗类风湿性关节炎和骨关节炎，近十几年来发现其具有抗肿瘤作用，作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，且抑制肿瘤血管生成并对周围组织的粘附侵袭有关。Survivin 是近年来发现的抗凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的新成员，在人类绝大多数恶性肿瘤中均
6、有表达，通过对抗细胞凋亡而有利于肿瘤的3生长。目前，有关 Celecoxib 与 survivin 的关系报道极少。我们研究的目的是要观察 Celecoxib 对肺癌 A549 细胞 survivin 表达的影响，探讨 Celecoxib 调节 survivin 表达进而促进 A549 细胞凋亡的分子机制。1 材料与方法1.1 材 料人肺癌 A549 细胞来自于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所；DMEM 培养液和胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；survivin 一抗及二抗购自北京中杉公司（美国 Santa Cruz 公司产品，进口分装） ；Celecoxib 购自辉瑞公司； PGE2 购自
7、 Sigma 公司；酶联免疫检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司；紫外分光光度计购自美国BACKMEN 公司；酶联免疫检测仪购自芬兰 Labsystems Dragon公司。1.2 方 法1.2.1 细胞培养及提取蛋白A549 细胞接种在含 10ml DMEM（含 10%小牛血清，青霉素和4链霉素各 100U/ml，下同）的直径 10cm 的培养皿中，置于 37 、5%CO2 无菌培养箱中培养，23d 换液， 0.25%的胰酶消化传代。为避免血清对实验的影响，待细胞长到 70%80%成熟时换无血清DMEM 培养液行 Celecoxib 干预。干预分为 Celecoxib 量效关系组和时效关系
8、组，每组 4 皿。Celecoxib 量效关系组每皿分别给予 Celecoxib 0、10、20 、40mol/L，12h 后裂解细胞提取蛋白；Celecoxib 时效关系组每皿分别给予 20mol/L 的Celecoxib，分别在 0、6 、12 、24h 裂解细胞提取蛋白。每皿在裂解细胞前先留取适量培养上清液，用于做 ELISA 检测 PGE2 含量。1.2.2 ELISA 检测培养上清液中 PGE2收集 Celecoxib 干预各个不同浓度点和时间点的细胞培养上清液，取 0.5ml 上清液加入 1N HCl 0.1ml，离心 10min，收集上清液再加入 1.2N NaOH 0.1ml
9、以中和酸性化了的样品。把 100l 的标准品或样品分别加入相应孔中，余下操作步骤按 PGE2 ELISA 试剂盒要求进行。在酶联免疫检测分析仪上测定 OD492nm 值，不加样品的孔作为空白对照孔用于调零，每一个标准品和样品均设置复孔，实验重复 3 次。1.2.3 Western blot 测量 survivin 表达5提取蛋白后 4低温超速（13 000r/min）离心，留取上清液，用考马斯亮蓝 G250 法测定每个样品的总蛋白含量。分离胶浓度为12%，积层胶浓度为 5%；每个加样孔的蛋白上样量为 100g。电泳时，积层胶为 80V 30min，分离胶为 120V 60min。电泳后制“三明
10、治”行湿性转膜 12h。5%PBS 脱脂奶粉封闭液封闭3h，PBS 液清洗 3 次，每次 15min；一抗孵育 2h（survivin 一抗按 1：200 稀释） ，清洗 3 次，每次 15min；二抗反应 50min（二抗按 1：3 500 稀释） ，清洗 3 次，每次 15min，ECL 显影。1.2.4 MTT 检测细胞凋亡情况为了确定 Celecoxib 是否通过 PGE2 途径影响细胞的凋亡， 96孔培养板中除设置 Celecoxib 量效关系组和时 效关系组外，还相应设置了 Celecoxib+PGE2 量效和时效关系组。每个浓度点和时间点均种 4 孔并设置对照，计算其 OD 值均
11、值。每孔接种细胞8 000 个，加入 10%DMEM 使总体积为 200l，培养 24h 细胞贴壁后进行干预。Celecoxib 量效关系组设0、10 、20、40mol/L 四个浓度点，分别用 A1B1C1D1 表示；Celecoxib+PGE2 量效关系组设 Celecoxib 0、10 、20、40mol/L 及 PGE2 100pg/ml 四个浓度点，分别用A2B2C2D2 表示；干预 12h 后每孔加入 MTT 液 20l(5mg/ml),震荡器震匀，继续培养 4h 后液体倒出拍干，每孔给予 DMSO 150l 6震匀 10min，送酶联免疫检测分析仪中计算其 OD490nm 值。C
12、elecoxib 时 效关系组设 6、12、24h3 个时间点，用 B3C3D3表示，分别每孔分别给予 Celecoxib 20mol/L； Celecoxib+PGE2 时- 效关系组设 6、12、24h3 个时间点，用B4C4D4 表示，每孔分别给予 Celecoxib 20mol/L 及 PGE2 100pg/ml；无干预对照时 效关系组用 B5C5D5 表示；操作方法与量 效关系组相同，分别在干预 6、12 、24h 后处理细胞进行实验。1.2.5 流式细胞检测细胞周期及凋亡收集不同浓度 Celecoxib（0、20、40mol/L ）处理 12h 后的A549 细胞， 0.25%胰酶
13、消化及 PBS 冲洗液，1 000r/min 离心10min，-20预冷的 80%乙醇固定，送北京鼎国生物实验室作细胞周期及细胞凋亡分析，实验重复 3 次。1.3 统计学处理计量资料均以 xs 表示，采用 SPSS11.0 统计软件包的 t 检验，P0.05 为有显著性意义。2 结 果72.1 ELISA 结果Celecoxib 对 PGE2 释放水平的影响：Celecoxib 能够抑制PGE2 的释放，这种抑制具有时间效应和剂量效应：20mol/L 的Celecoxib 处理 6、12、24h PGE2 水平分别为（ 38.94.62）pg/ml， （22.233.89 ）pg/ml， （1
14、1.083.61）pg/ml，与对照组（0h） （47.625.51 ）pg/ml 相比较，其差异有统计学意义（P值分别0.05，0.01，0.01） ；10、20、40mol/L 的 Celecoxib处理 PGE2 水平分别为（35.234.12）pg/ml， （21.013.17）pg/ml， （6.922.35）pg/ml，与对照组（0mol/L）（46.274.88）pg/ml 相比较，其差异也有统计学意义 ( P 值分别0.05，0.01，0.01)。2.2 Western blot 结果如图 1A、B，可见随着 Celecoxib 作用时间的延长和剂量的增加，survivin 表
15、达的条带逐渐减弱（图 1C 为 -actine 参照） ，说明Celecoxib 能够抑制 survivin 表达。2.3 MTT 结果（OD 值）MTT 实验结果显示，随着 Celecoxib 剂量的增加其 OD 值如图82A：A1B1C1D1 分别为 0.4124，0.2967， 0.1014，0.0025；A2B2C2D2 分别为0.5578，0.3997，0.2834，0.0956，差异有显著性（P0.01） ，说明细胞凋亡显著增加，并且 PGE2 对其有明显的对抗作用；随着时间的延长，也出现细胞增殖减少而凋亡明显增加，OD 值如图2B：B3C3D3 分别为 0.1572，0.1108
16、，0.0419；B4C4D4 分别为 0.3194，0.2996，0.2838；B5C5D5 分别为 0.3846，0.4457，0.7652，差异具有显著性（P0.01） ，PGE2 也显示了明显对抗 Celecoxib 的作用。说明 Celecoxib 能够诱导细胞凋亡并且是通过抑制 PGE2 的释放实现。2.4 流式细胞检测结果流式检测结果如图 3 所示，Celecoxib 20mol/L 时 G1/G0 为67.82，而 40mol/L 时 G1/G0 为 75.52，两者比较差异有显著性（P 0.01） ；两者与对照组（G1/G0 56.6）比较，差异有显著性（P 0.01） ，说明 Celecoxib 能够使细胞增殖阻滞于 G1/G0 期。3 讨 论Survivin 基因是 IAP 家族的一个新成员，在各种人类恶性肿瘤细胞中均有不同程度的表达。Su
