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1、1CD44v6 和 LYVE1 蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义作者：陈睿,汪蕊, 杨婉华 ,马湘一,卢运萍, 王世宣,马丁【摘要 】 目的 探讨 CD44v6 和 LYVE1 蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法 应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连接（SP ）法检测 CD44v6、和 LYVE1 在 63 例卵巢上皮性癌、5 例卵巢良性上皮性肿瘤和 4 例正常卵巢组织中的表达情况。结果 正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤和卵巢上皮性癌中CD44v6 和 LYVE1 蛋白的表达具有显著差异；CD44v6 表达强度与卵巢癌临床分期和组织学分级呈正相关，LYVE1 的表达和卵巢癌的临
2、床分期正相关，而不同组织学分级间差异无显著性；CD44v6 和 LYVE1 的表达强度与淋巴结有无转移显著相关；CD44v6 和 LYVE1 在卵巢癌中协同表达。结论 CD44v6 和LYVE1 在卵巢癌发生发展、和淋巴转移中起不同程度的作用，其检测可为卵巢肿瘤生物学行为判定提供参考依据。 【关键词】 卵巢上皮性肿瘤CD44v6；LYVE1 免疫组织化学Clinical Significance of Expression of CD44v6 and 2LYVE1 in Epithelial Ovarian TumorKey words：Epithelial ovarian carcinoma
3、;CD44v6;LYVE1;Immunohistochemistry肿瘤的侵袭转移是个复杂多步骤过程，与肿瘤细胞的粘附、新生血管形成和淋巴道转移等有关。研究表明,细胞表面粘附分子CD44 变异体主要表达于上皮源性细胞和肿瘤细胞,其中尤以CD44v6 与肿瘤细胞浸润、转移趋势和不良预后密切相关1。LYVE1 是淋巴管壁透明质酸(HA)的主要受体，且是肿瘤组织淋巴管形成的特异标志2。但 CD44v6 和 LYVE1 与卵巢癌的发生发展有无关系、是否存在协同作用，目前报道甚少。本课题应用免疫组织化学方法同时检测卵巢癌组织中 CD44v6 和 LYVE1 的表达情况，试图探讨它们与卵巢癌临床病理关系及
4、其在卵巢癌发生发展中的作用。1 材料与方法1.1 材料收集 20022004 年华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科保存卵巢上皮性癌标本 63 例，其中浆液性囊腺癌 45 例，粘液3性囊腺癌 18 例，术前均未接受过化学治疗和放射治疗。临床分期按国际妇产科联盟（FIGO）2000 年标准：I 期 12 例、II 期 18 例、III 期 13 例、IV 期 20 例。根据 WHO 组织分级标准分级：I 级 17例、II 级 27 例、III 级 19 例。同期随机选取正常卵巢组织 4 例，卵巢良性上皮性肿瘤 15 例。1.2 试剂鼠抗人 CD44v6 蛋白 mAb 为 Bender 公司产
5、品，羊抗人LYVE1 蛋白抗体购自美国 santa cruz Biotechology Inc 公司，SP 试剂盒购自北京中山生物公司。1.3 实验方法石蜡包埋标本，4m 连续切片，经微波抗原修复、血清封闭、一抗二抗孵育、进行免疫组化染色(SP 法),抗体工作浓度 1250。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用 CD44v6 和LYVE1 乳腺癌阳性片作阳性对照。1.4 判定标准染色阳性表达为棕黄色，根据阳性细胞所占比例判定：阳性细胞45%者为阴性 (-)； 5%50%者为阳性(+)；50%者为强阳性(+)。1.5 统计学处理应用 SPSS11.0 软件处理，根据数据来源和统计学要
6、求采用 2检验。2 结果2.1CD44v6 和 LYVE1 在不同卵巢组织中的表达CD44v6 染色主要存在于细胞膜；LYVE1 染色主要存在于细胞浆，细胞膜亦有部分染色，见图 1。CD44v6 和 LYVE1 在卵巢上皮性癌组织中的表达均明显高于卵巢良性肿瘤和卵巢正常组织，差异具有显著性，P 均0.05)。在卵巢癌 I 期、期和期不同临床分期中，5CD44v6 和 LYVE1 表达率明均显增高，且差异有显著性(P0.05)，提示其表达与卵巢癌临床分期呈正相关。在卵巢癌高、中和低分化不同组织学分级间，CD44v6 表达率分别为64.71%、85.19%及 89.47%，在低分化癌的表达率明显高
7、于高分化癌(P0.05)。CD44v6 和 LYVE1 在有淋巴结转移组中的表达率明显高于无淋巴结转移组，且差异有显著性意义,见表 2。表 2 卵巢癌中 CD44v6、LYVE1 表达与临床病理学参数的关系2.3 卵巢癌中 CD44v6 和 LYVE1 蛋白表达的相关性CD44v6 和 LYVE1 蛋白在卵巢癌中的表达经统计学分析，两者表达有相关性（P0.05 ） ，见表 3。表 3CD44v6、LYVE1 在卵巢癌中共同表达的相互关系3 讨论3.1 粘附分子 CD44v6 和卵巢癌CD44 是广泛存在于细胞表面的一类糖蛋白，在人类，其基因定位于染色体 11p13，至少由 20 个外显子构成，
8、其中 10 个为组成型外显子，其余为 V 区变异拼接外显子。仅含有组成型外显子的6CD44 转录子称为标准 CD44（CD44s） ，而在区选择性插入变异性外显子的称变异型 CD44（CD44v ） ，V 区外显子既能以连续方式拼接，也能以跳跃方式拼接，从而可得到众多同工型基因(CD44v1CD44v10)，而 CD44v6 因与肿瘤侵袭转移关系密切而于近年受到高度重视。Stiskeler 等3 用敏感的酶联免疫吸附法检测卵巢癌患者血清中CD44v6 含量与淋巴结转移的关系，结果显示，与无淋巴结转移的患者相比，淋巴结转移的患者血清中可溶性 CD44v6 含量明显升高。也有一些学者4发现恶性与良
9、性卵巢肿瘤及正常卵巢组织相比，CD44 表达失控，但却未发现任何一种 CD44（包括 CD44v6）与年龄、临床症状、肿瘤大小、激素受体状况、组织级别等临床诊断评价标准之间有明确的相关性。本研究发现 CD44v6 不仅在卵巢上皮性癌中表达水平明显高于较卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织，差异具有显著性，而且表达强度与卵巢癌病理分期、组织学分级和淋巴结转移呈正相关，推断 CD44v6 与卵巢癌的发生、侵袭转移有关。CD44v6 与卵巢上皮性癌分型、分化、分期之间的关系，我们可以通过比较 CD44v6 在卵巢上皮性癌不同病理类型间的表达差异，和不同分化、分期间CD44v6 表达强度的差异来证实。如果
10、这种关系得以明确，我们可通过癌组织 CD44v6 表达程度、所处 FIGO 分期来制定临床治疗方7案。3.2LYVE1 与卵巢癌Carla 等5研究表明，LYVE1 表达不仅局限于淋巴管，还表达于正常人肝血窦内皮细胞。Sanna 等6研究表明在头颈部鳞状细胞癌中，肿瘤周边存在高密度的 LYVE1 阳性脉管提示较高的生存率。Sahni 等7通过对恶性黑色素瘤的研究发现，LYVE1 阳性仅能提示淋巴系统中存在黑色素瘤细胞，而不能说明肿瘤的转移。本研究用 LYVE1 单抗对正常卵巢组织，卵巢良性上皮性肿瘤及卵巢上皮性癌进行检测，各组间表达有明显差异。LYVE1 与卵巢上皮性癌临床分期呈正相关而不同组
11、织学分级间无明显差异。LYVE1 表达与卵巢上皮性癌淋巴转移有关，临床上对卵巢癌及癌旁组织进行 LYVE1 检测，有助于肿瘤转移潜能的预测。3.3CD44v6 与 LYVE1 协同表达意义在恶性肿瘤发生、发展和转移的各阶段，许多学者提出协同作用假说，认为至少有两个或两个以上功能不同的异常激活基因，各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合协同促进细胞的癌变8。本研究发现，LYVE1 在卵巢癌中的表达与 CD44v6 表达关系密切，8且均与临床分期呈正相关，推测 CD44v6 和 LYVE1 在卵巢癌发生发展、侵袭、转移尤其是淋巴转移过程中存在协同作用。提示联合检测 CD44v6 和 LYVE1
12、 对判断卵巢癌的恶性程度及生物学行为是一项有意义的综合性指标。以上研究表明，CD44v6 和 LYVE1 与卵巢癌的淋巴转移密切相关，其表达标志着肿瘤细胞具有较高淋巴转移潜能，而 CD44v6和 LYVE1 表达阴性的肿瘤细胞，可能无淋巴转移能力或转移能力低下。对于上述推测，我们正通过对研究对象的跟踪随访，对患者长期生存率，肿瘤复发和转移情况进一步收集整理。如果我们的假说得到佐证，其意义在于，CD44v6 和 LYVE1 可作为一种有效的肿瘤预后标志物，用以指导对卵巢癌患者的临床治疗。【参考文献】1 Chuang CK,Liao SK.Differential expression of CD
13、44variant isoforms by cell lines and tissue specimens of transitional cell carcinomas J .Anticancer Res,2003,23(6C):4635.2He Y,Karpanen T，et al.Role of lymphagiogenic fators in tumor metastasisJ.Biochim Biophys Acta,2004,1654(1):312.93Stickeler E,Vogl FD,Denkinger T,et al.CD44 splice variants and pe
14、lvic lymphnode metastasis in ovarian cancer patientsJ.Int J Mol Med,2000,6(5):595601.4Sanchez Lockhart M,Hajos SE,Basilio FM,et al.Splice variant expression of CD44 in patients with breast and ovarian cancerJ.Oncol Rep,2001,8(1):145151.5Mouta C C,Nasser SM,Di Tomaso E,et al.LYVE1 is not restricted t
15、o the lymph vessels expression in normal liver blood sinusoids and downregulation in human liver cancer and cirrhosisJ.Cancer Res,2001,61(22):80798084.6Maula SM,Luukkaa M,Grenman R,et al.Intratumoral llymphatics are essential for the Metastatic spread and prognosis in squamous cell carcinomas of the head and neck regionJ.Cancer Res,2003,63(23):85558556.7Sahni D,Robson A,Orchard G,et al.The use of LYVE1 antibody for detecting lymphatic involvement in patients with malignant melanoma o
