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1、1bcl2 家族 BH3only 蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用作者：谢奇朋，叶 艳，郝延璋，张旭东，张林杰【摘要 】 目的 研究 bcl2 家族 BH3only 蛋白 Noxa、Bim 和PUMA 在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用。方法 Annexin VFITC 染色，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，半定量RTPCR 检测细胞中 BH3only 蛋白的 mRNA 表达量。结果 依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量、时间依赖性，SGC7901 细胞系比 BGC823 更加敏感，100M 的依托泊苷作用 48 小时后SGC7901 的凋亡率达到 50%，而 BGC823 的凋亡
2、率只有20%。BH3only 蛋白 Noxa 的 mRNA 表达明显上调，Bim 少量上调与依托泊苷诱导的细胞凋亡有关系；相反，PUMA 的 mRNA表达量在依托泊苷治疗前后没有变化。结论 依托泊苷诱导的胃腺癌细胞凋亡与 BH3only 蛋白 Noxa 和 Bim 表达上调有关联。 【关键词】 Noxa；Bim；PUMA；胃腺癌；细胞凋亡；依托泊苷Key words：Noxa；Bim；PUMA；Gastric 2adenocarcinoma；Apoptosis ；Etoposide胃癌是常见的恶性肿瘤之一。化疗药物依托泊苷（又名VP16、鬼臼乙叉甙）为细胞周期特异性抗肿瘤药物，依托泊苷可以与
3、DNA 拓扑异构酶 II 相互作用形成药物 酶DNA 稳定的可逆性复合物，阻碍 DNA 修复，从而诱导细胞凋亡。BH3only 蛋白是近年来研究比较热门的一类 bcl2 家族中具有凋亡启动作用的亚家族, 包括 Bim（bcl2 interacting mediator of cell death） ，Noxa（PMAIP1） ，Puma（p53 upregulated modulator of apoptosis） ，Bad，Bmf 等，通过与 bcl2/bax 相互作用启动“内源性”凋亡途径，导致细胞凋亡。Noxa 和 PUMA 主要受 p53 调节，细胞 DNA 损伤后通过 p53 可以上
4、调 Noxa 和 PUMA 的表达1 ；Bim 主要结合在微管动力蛋白上，受到细胞因子去除、Ca2+ 流出、紫外线照射、微管动摇和紫杉醇等刺激后可以转移到线粒体膜上2 ，从而发挥促凋亡活性。本研究使用依托泊苷作用胃腺癌细胞，检测 BH3only 蛋白的表达与细胞凋亡之间的关系，研究依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的分子机制。1 材料和方法1.1 材料3依托泊苷购自沈阳科瑞斯德医药科技有限公司；SGC7901 和BGC823 胃腺癌细胞购自上海生命科学院细胞库，Annexin V 为caltag 公司产品；TRIzol 为 Invitrogen 公司产品；逆转录试剂盒为 Promega 公司产品；引物
5、由上海生工生物工程公司合成。1.2 主要实验仪器流式细胞仪型号为 FACScalibur；PCR 仪为 MJ RESEARCH .INC 公司的 PTC100；凝胶成像系统为黑马公司产品；电泳仪为北京六一仪器厂产品。1.3 细胞培养及药物配制SGC7901 和 BGC823 细胞接种于含有 10%小牛血清（FCS） 、1%双抗、1%L 谷胺酰胺的 DEME 培养液中，在 37，CO2 浓度为 5%的培养箱中生长，每 23d 传代一次。依托泊苷用 DMEM培养液配制成 10 000M 贮存液，在20 中保存，临用前稀释成所需浓度。1.4 流式细胞术用酶消化法收集不同浓度依托泊苷诱导各个时点的细胞
6、，冰冷4PBS 洗涤两遍，binding buffer 重悬细胞，调整细胞密度为5105/ml，取 195l 细胞悬液加 5l Annexin V 混匀避光作用30min。流式细胞仪在 488nm 激发波长处进行检测，实验重复 3次，取平均值，结果用 WINMDI2.8 软件分析。1.5 RNA 提取及质量鉴定按 TRIzol 说明提取细胞总 RNA，紫外分光光度计鉴定样品的纯度和浓度。测得的 A260/A280 均在 1.82.0 之间，RNA 电泳可见清晰的 28S、18S 和 5S 三条带，RNA 用 PCR 扩增 GAPDH 无产物，表明所提取的 RNA 中没有 DNA 污染。1.6
7、半定量 RTPCR逆转录按照 Promega 逆转录试剂盒说明操作，各个标本调整到同一浓度再进行逆转录。内参照为 GAPDH，引物：GAPDH（580bp）上游：AATCCCATCACCA TCTTCCA，下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTG，Noxa（196） ，上游：AGATGC CTGGGAAGAAG，下游：AGTCCCCTCATGCAAGT，Bim（204bp） ，上游：GCCCCT ACCTCCCTACAGAC，下游：ATGGTGGTGGCCATACAAAT，Puma（212bp ） ，上游：5GCCCAGACTGTGAATCCTGT，下游：TCCTCCCTCTTCCGAG
8、ATTT，PCR 的反应程序为： 94 5min 后进入循环，每循环为 94 30s，55 30s 72 30s，32 个循环，最后是 72延伸 7min ，内参照 GAPDH 的引物在第 8 个循环后加入，扩增 24 个循环。取 8l PCR 反应产物，在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳，80V，1h，在黑马凝胶成像系统拍照。以 GAPDH 的表达强度为对照观察 Noxa、Bim 和 Puma 的相对表达强度。2 结果2.1 依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡我们用 50M、100M、250M 和 400M 四个浓度的依托泊苷作用 SGC7901 细胞 48h，然后用 FITCAnnexin V 染色流式
9、细胞仪检测凋亡细胞。结果显示随着依托泊苷浓度的增加，细胞的凋亡率不断增加，见图 1a，半数抑制浓度 IC50 为 100M。然后我们用 100M 的依托泊苷作用 SGC7901 细胞8h、16h 、 24h、36h 和 48h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，见图 1b，结果显示依托泊苷作用 8h 即有细胞发生凋亡，随着时间的增加，凋亡也不断增加，48h 达到 50%，由此我们可以得出依托泊苷诱导 SGC7901 胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性。然后我们用 100M 的依托泊苷作用 BGC823 胃腺癌细胞 48h，流式细6胞仪检测凋亡率为 20%，与 SGC7901 的结果比较，我们得出SG
10、C7901 为依托泊苷敏感细胞株，而 BGC823 为不敏感细胞株。流式细胞仪检测细胞凋亡结果见图 2。2.2 依托泊苷能上调敏感细胞株 SGC7901 中 Noxa mRNA 表达在 SGC7901 和 BGC823 细胞株中 Bim 的 mRNA 表达都上调。将 100M 的依托泊苷分别作用 SGC7901 和 BGC823 胃腺癌细胞 0h、4h、8h 、 16h 和 24h，然后检测 Noxa、Bim 和PUMA 的 mRNA 表达水平。结果显示在 SGC7901 细胞中，Noxa 的 mRNA 表达早在 4h 即开始明显增加，8h 达到高峰，见图3a。在 BGC823 细胞中，Nox
11、a 的 mRNA 表达无明显变化，见图3b。Bim 的 mRNA 在两个细胞系中均表达上调，不过开始升高的时间靠后，在 SGC7901 中 8h 开始升高，见图 3c，在 BGC823中 16h 开始升高，见图 3d，而且升高的幅度没有 Noxa 的 mRNA大。两个细胞系在依托泊苷诱导后 PUMA 的 mRNA 表达没有变化（结果尚未发表） 。3 讨论7化疗药物主要通过诱导细胞发生线粒体途径即内源性细胞凋亡来起作用，bcl2 家族在线粒体途径凋亡中起重要作用。bcl2 家族包括 bcl23 、bax4和 BH3only 三个亚家族5 ，bcl2亚家族含有 4 个 BH 域抑制凋亡发生， ba
12、x 亚家族含有多个 BH 域，促进凋亡，而 BH3only 亚家族只含有一个 BH3 域，包括Noxa、Puma、Bim 等，正常细胞中，bcl2 亚家族和 bax 亚家族处于平衡状态不发生凋亡，BH3only 蛋白的 BH3 域是两性螺旋，其亲水面能与 bcl2 亚家族 BH1、BH2 、 BH3 形成的亲水槽结合，置换出 bax 亚家族从而发挥促凋亡作用。bax 亚家族寡聚化插入线粒体，使 PT 孔开放，线粒体外膜通透性增加而使线粒体内的细胞色素 C 和 Smac/DIABLO 释放入胞浆，细胞色素 C 与Apaf1、dATP 组成凋亡体，激活 caspase 级联反应，最后由caspas
13、e3 裂解细胞中关键蛋白而使细胞发生凋亡。Noxa 和 PUMA 的表达主要受 p53 调节。当细胞 DNA 损伤时，p53 被激活，通过诱导 p21WAF1 使细胞周期停滞，以便对 DNA损伤进行修复6 ；如果损伤严重无法修复时，p53 通过做为转录因子激活 Noxa、Puma 等来诱导细胞凋亡。何种下游基因被激活取决于细胞类型和细胞状态，例如在宫颈癌细胞、造血干细胞7 、神经母细胞瘤8中通过 Noxa，在结肠癌细胞中则通过 PUMA来诱导凋亡9 。Bim 在人类乳腺癌、前列腺癌以及非小细胞性肺癌细胞系中均有表达，并且在一定刺激下 Bim 的表达上调能引起肿8瘤细胞凋亡1012 。本课题着重
14、研究在胃腺癌细胞凋亡中 BH3only 蛋白的作用，依托泊苷为 DNA 损伤化疗药物，主要通过 p53 途径诱导细胞凋亡，我们结果表明依托泊苷作用后 SGC7901 细胞发生明显的凋亡，48h 凋亡率达到 50%，Noxa 的 mRNA 表达明显增高，但是PUMA 没有变化，表明在 SGC7901 胃腺癌细胞中 p53 主要通过Noxa 而不是 PUMA 来诱导细胞凋亡。BGC823 细胞对依托泊苷不是很敏感，48h 凋亡率只有 20%，而且 Noxa 和 PUMA 的mRNA 表达均没有变化。BGC823 是低分化胃腺癌细胞，可能p53 发生突变所以不能诱导下游基因的表达，文献报导在 50%
15、以上的肿瘤中都发现有 p53 的缺失或者突变13 。或者依托泊苷诱导BGC823 细胞的凋亡不通过 p53 途径，还存在其他途径。在两个细胞系中均有 Bim 的 mRNA 表达增高，这表明 DNA 损伤也可以通过 Bim 途径来诱导凋亡，但是 Bim 的 mRNA 开始升高的时间比较迟，且幅度比 Noxa 小，说明在依托泊苷诱导SGC7901 细胞凋亡中 Noxa 起主要作用，而 Bim 起次要作用。BGC823 细胞虽然对依托泊苷不敏感，但还是有 20%的凋亡率，可能是通过 Bim 来诱导细胞凋亡的。总之，我们的研究发现依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡与9BH3only 蛋白 Noxa 和 Bim
16、 表达上调有关联，这为治疗胃肿瘤带来新的治疗靶点。Noxa 和 Bim 在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的确切作用还有待于用 siRNA 技术进一步研究。【参考文献】 1 Villunger A, Michalak EM, Coultas L, et al. p53 and DrugInduced Apoptotic Responses Mediated by Bh3Only Proteins Puma and NoxaJ . Science, 2003, 302(5647):10361038.2Puthalakath H, Huang DC, OReilly LA, et al. The proapoptotic activity of the Bcl2
