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1、立题依据研究目的和意义肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的健康。 化疗在预防HCC复发和转移中发挥着不可替代的作用。多药耐药现象是影响HCC化疗的主要障碍。研究发现导致HCC发生多药耐药的机制之一是凋亡调控基因介导机制的紊乱。Survivin不仅与HCC的发生、发展、预后及复发密切相关，而且是凋亡调控基因介导机制中的一种新耐药相关凋亡基因。本项目是在原有的工作基础上，利用RNA干扰技术抑制与凋亡调控基因survivin的表达，逆转其多药耐药性，旨在为进一步明确HCC多药耐药和逆转多药耐药机制的研究提供理论基础，同时为临床解
2、决化疗耐药的“瓶颈”提供有益探讨，也为其他恶性肿瘤化疗耐药研究提供新的思路。国内、外研究现状和发展趋势肝细胞性肝癌( Hepatocellular carcinoma ，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌95%，每年约有55万人被确诊为HCC，以东南亚国家及非洲等地区高发。我国是HCC的高发区，死亡率占恶性肿瘤第二位，发病率亦有增高趋势。导致HCC的主要危险因素有肝炎病毒感染、肝硬化、长期进食被黄曲霉毒素污染的食物。由于HCC早期缺乏典型症状，起病隐匿，极易侵犯门静脉分支，癌栓经门静脉系统形成肝内播散，确诊时往往已处于进展期，预后很差，如不治疗常于半年内死亡，因而成为治疗上最困
3、难的肿瘤之一1-2。目前对HCC有多种治疗方法可供选择，除手术切除、肝移植、射频消融、无水乙醇或乙酸注射、液氮冷冻、激光气化及微波热凝等方法外，化疗作为各种治疗的辅助治疗在预防复发和转移中发挥着不可替代的作用。HCC对多种化疗药均具有广泛的耐药性3-4，是阻碍HCC化疗效果的主要屏障。因此开展对HCC的多药耐药机理和逆转方法的研究具有极其重要的意义。多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤对未接触过的、结构不同、靶位各异的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。它是恶性肿瘤化疗治疗失败的主要原因。肿瘤细胞的抗药性两类:一是先天性,即肿瘤细胞对抗癌药物天然不敏感; 二是后天
4、获得性,即肿瘤耐药细胞因抗癌药物的诱导及其他因素的激活产生抗药性。多药耐药的可能机制主要包括 除与膜糖蛋白介导的药物外排泵机制及酶介导机制外，还与凋亡调控基因介导机制密切相关5。抗肿瘤药物主要通过诱导细胞凋亡发挥作用, 其中与耐药相关的基因包括bcl-2 家族、Survivin、p53 、c-myc 等。肿瘤细胞的耐药是细胞凋亡的抑制, 参与细胞凋亡调控的基因的表达失控是导致肿瘤细胞对化疗药物耐受的原因之一。因此，沉默这些细胞调控基因的过表达能有效可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、克服耐药性的产生6。Survivin是凋亡抑制蛋白( inhibitors of apoptosis protei
5、n，IAP) 家族成员之一。由耶鲁大学的Altieri等在1997年应用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cellproteasa receptor-1, EPR-1)的cDNA，通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来7。Survivin的表达具有高度的肿瘤特异性, 在多数肿瘤组织中均有表达, 而在大多数正常组织中不表达，研究证实Survivin具有抗凋亡和调节细胞分裂的双重功能8。研究显示，survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子9。目前研究已知的survivin抗凋亡的作用机制包括以下几个途径10-11:抑制效应蛋白caspase-3、caspase-7的激活和活性
6、；抑制caspase-3的活性； 介导P21蛋白和caspase-3前酶复合物的形成；与第二个线粒体起源的caspase激活剂Samc/DIABLO分子结合。其中caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡效应蛋白，其激活是凋亡信息转导的关键。Survivin区别于IAP家族其它成员的独特之处在于Survivin在分化成熟的正常组织中很少表达，而在HCC等大多数肿瘤组织中呈高表达12。Survivin不仅与肝癌细胞的生成、生长、增殖、 凋亡、血管生、演变成及预后明显相关13-15 ，而且与HCC耐药机制的形成有关，能增加肿瘤细胞对放疗的耐受性16-17 , 因此抑制survivin的表
7、达能干预肿瘤耐药的产生。通过阻止Survivin的表达能有效诱导细胞凋亡，以及促进对化疗药物的敏感性，并达到治疗肿瘤的目的，故以survivin 作为靶基因治疗具有重大意义。RNA 干扰（RNA interference, RNAi ) 现象首先由Fire 等18发现于秀丽隐杆线虫，随后相继在植物、真菌、果蝇及哺乳动物细胞内发现。RNAi是一种序列特异的转录后基因沉默现象，是双链RNA导入细胞或通过载体在细胞内转录成具有发夹结构的双链RNA，能够高效特异地剔除同源基因表达，形成相应的功能缺陷表型的一种技术 。目前已明确作用机制是RNAi在真核细胞中的发生过程是通过一个被称之为Dicer的酶，将
8、dsRNA裂解成21-25核苷酸的小干扰RNA（siRNA）。siRNA变成细胞内RNA诱导沉默复合体的一部分，该复合物通过互补靶定将要降解的细胞内的mRNA，最终将细胞中的基因表达阻断19。随着对siRNA研究的不断深入, 越来越多的研究显示siRNA 在基因治疗的潜在优势。与其他几种基因封闭技术相比, siRNA 具有更强大、更持久的抑制基因表达的能力, 如其效能是反义寡核苷酸100-10000 倍20；siRNA具有序列特异性高、无免疫原性及体积小等优点，这就为治疗诸如癌症这类由于多基因表达失调导致的疾病提供了可能21。自从2001年Elbashi等22首次报道siRNA在哺乳动物体外培
9、养细胞内成功诱导基因特异性抑制后，siRNA在人类疾病治疗方面的研究倍受关注，因其具有高效性和高度特异性等优点，为传染病、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指明了一条新路。采用RNAi技术在膀胱癌、乳腺癌、白血病、HCC等人类肿瘤细胞株体外内抑制实验中均己获得了成功23-25。此外，在肿瘤多药耐药研究方面也取得了可喜的成果，研究人员采用RNAi技术特异性的有效的逆转了mdrl基因介导的胰腺癌和胃癌耐药细胞株的多药耐药26； Ee等27在乳腺癌多药耐药研究中，针对ABCG2基因设计的siRNA有效的抑制了该基因的表达; 在子宫恶性肿瘤、卵巢癌、白血病及胃癌等的耐药性逆转研究中也取得了成功28-30。本
10、研究选择的Stealth RNA，它是经过专门化学修饰的，由25个碱基对组成，可消除诱导的细胞应激效应发生，研究显示Stealth RNA具有以下优点31： 更高的特异性； 更明晰的结果； 更佳的稳定性。参考文献1.Bruix J, Sala M, Llovet JM. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 2004, 127: 179-1882.Yang JY, Luo HY, Lin QY, Liu ZM, Yan LN, Lin P, et al. Subcellular daunorubici
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