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1、第四章 基因工程的主要技术与原理 周毅峰 2019 03 核酸的提取与纯化 核酸电泳 分子杂交 PCR技术 DNA序列分析 大分子相互作用 1 核酸的提取与纯化 破碎细胞或包膜 内容物释放 材料准备 核酸分离 纯化 沉淀或吸附核酸 并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中 20 60bp 1 1 基因组DNA的提取与纯化 DNA溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 DNA钠盐比游离态更易溶于水 DNP在0 14mol LNaCl中的溶解度是水中的1 DNP在1mol LNaCl中的溶解度是水中的2倍 生物材料的准备 新鲜 或者冻存的样品 液氮中研磨加缓冲液 EDTA螯合Mg2 Ca2 SDS变性蛋
2、白质 巯基乙醇 DTT打开二硫键和抗氧化 PVP与酚和多糖结合及抗氧化 裂解细胞 除杂 加CTAB或SDS结合多糖和蛋白 加酚仿去蛋白 纯化与保存 加乙醇或异丙醇沉淀 加乙醇反洗涤 吹干 水或TE溶解 20 保存 基因组DNA的提取 酚抽提法 样品的准备 细胞的裂解 蛋白质变性 DNA的抽提 DNA的沉淀 血基因组DNA试剂盒 酵母基因组DNA试剂盒 细菌基因组DNA试剂盒 细胞基因组DNA试剂盒 q CTAB法流程图 植物材料裂解液 上层溶液 液氮研磨抽提 细胞裂解干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 q SDS法流程图 以动物组织为例 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶
3、解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同 将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂 同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 浓盐法 有机溶剂抽提法 密度梯度离心法 核酸分离 纯化核酸分离 纯化 q 蛋白质的去除 酚 氯仿抽提 使用变性剂变性 SDS 异硫氰酸胍等 高盐洗涤 蛋白酶处理 q多糖的去除 高盐法 用乙醇沉淀时 在待沉淀溶液中加入1 2体积的5M NaCl 高盐可溶解多糖 用多糖水解酶将多糖降解 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 1 2体积 氯苯可以与多糖的 羟基作用 从而去除多糖 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA 在500 L
4、DNA液中加入200 l 20 PEG8000 含1 2 M NaCl 冰浴20min 核酸分离 纯化核酸分离 纯化 q 多酚的去除 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂 巯基乙醇 抗坏血酸 半胱氨酸 二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂 如PVP PEG 聚乙二醇 它 们与酚类有较强的亲和力 可防止酚类与DNA的结合 核酸分离 纯化核酸分离 纯化 q 盐离子的去除 70 的乙醇洗涤 CTAB溶液配制好备用 65 水浴预热 猕猴桃叶片或果实采取后最 好立即放到液氮中 避免酚类物质氧化 65 水浴一个小时 氯仿 乙醇 异戊醇 80 16 4的抽提液 两次 10000转 分离心20分钟 尽量把丝状物压
5、紧 避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 75 乙醇洗去其他杂质 洗两次 用无水乙醇5毫升洗一次 晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3 5mlTE溶解 加入5ul 1mg ml的RNA酶后保存 猕猴桃DNA提取实例 q CTAB提取缓冲液的改进配方 猕猴桃基因组DNA 闭合环状的质粒DNA 在变性后不会分离 复性快 原理 1 2 碱裂解法提取质粒DNA DNA双链 变性 DNA单链 复性 强碱 中性 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离 难以复性 而形成缠绕的结构 与蛋白质 SDS复合物结合在一起 当K 取代 Na 时 生成不溶的PDS 这些复合物从溶液中沉淀下来 变性 利用
6、宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构 状态的差异来提取质粒DNA 当同时碱变性时 线状基因组DNA变性充分而质粒DNA 处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开 当条件恢复时 酸中和 质粒DNA迅速准确配置重新 形成完全天然超螺旋分子 而线状DNA则与破裂的细胞壁 细菌蛋白相互缠绕成大型复合物 被SDS包盖 当K 取代Na 时 这些复合物会从溶液中沉淀下来 附在 细胞碎片上一起被离心除去 碱裂解法 所用的试剂作用 葡萄糖 增加溶液的粘度 维持渗透压 防止DNA受机械力 震荡 的作用而 降解 EDTA Mg2 Ca 2 的螯合剂 可抑制DNA酶的活性 防止DNA被酶降解 NaOH SDS
7、 NaOH 强碱 提供pH 12的碱性条件 使DNA双链变性 SDS 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白 并结合成 蛋白 SDS 复合物 使蛋白质 包括DNA酶 变性沉淀 冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4 8 用来中和NaOH变性液 使DNA复性 高浓度的K 置换Na 生成不溶的PDS 用于沉淀DNA 乙醇 DNA分子以水合状态 溶于 水里 乙醇能夺去DNA分子的水环境 KAc HAc缓冲液 RNase A 降解RNA渣滓 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA TE缓冲液 DNA保存液 由Tris HCl和EDTA配制 Tris HCl维持溶液中pH值相对稳定 EDTA抑制DNA酶 防止DNA被酶降解
8、 蛋白变性剂 进一步抽提DNA溶液中的蛋白质 使蛋白质沉淀 但苯酚会残留在DNA溶液中 现多用各种商品化的层析柱纯化DNA 酚 氯仿 选用 以上试剂有商业试剂盒 也可以自己配制 碱抽提法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的配制 使用 溶液 悬浮菌体 第一步 悬浮菌体 25mM Tris HCl pH8 0 10mM EDTA 溶液II 破坏细胞膜 蛋白质和DNA变性 第二步 破膜 蛋白质和DNA变性 Solution II 的配制 0 2N NaOH 1 0 SDS 第三步 中和 溶液III使DNA复性 并促使蛋白质 SDS复合物和染色体DNA沉淀 Solution III的配制 5
9、M 乙酸钾 用冰醋酸调pH至4 8 上清液中含有闭合质粒DNA 第四步 离心除去沉淀 0 6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇 第五步 纯化DNA 上清液过柱或酚 氯仿抽提 第六步 沉淀DNA 材料准备材料准备 最好使用新鲜材料 低温保存的 样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时 要选 择有核细胞 白细胞 组培细胞培养时间不能过长 否 则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少 提取前先富集 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 使用处于对数期的新鲜菌体 老 化菌体导致开环质粒增加 培养时应加入筛选压力 否则菌 体易污染 质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒 如为低 拷贝或大质粒 则应加大
10、菌体用 量 菌株不要频繁转接 质粒丢失 细胞裂解细胞裂解 材料应适量 过多会影响裂解 导致DNA量少 纯度低 针对不同材料 选择适当的裂 解预处理方式 植物材料 液氮研磨 动物组织 匀浆或液氮研磨 组培细胞 蛋白酶K 细菌 溶菌酶破壁 酵母 破壁酶或玻璃珠 高温温浴时 定时轻柔振荡 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 菌体量适当 培养基去除干净 同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长 5分钟 否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长 否则会 有基因组DNA的污染 G 菌 酵母质粒的提取 应先 用酶法或机械法处理 以破壁 核酸分离 纯化核酸分离 纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时
11、 应提供相 应的缓冲体系 采用有机 酚 氯仿 抽提时应充分混匀 但动作 要轻柔 离心分离两相时 应保证一定的转速和时间 猕 猴桃大提 10000转20min 针对不同材料的特点 在提取过程中辅以相应的 去杂质的方法 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 核酸沉淀 溶解核酸沉淀 溶解 当沉淀时间有限时 用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 沉 淀会更充分 沉淀时加入1 10体积的NaAc pH5 2 3M 有利于 充分沉淀 沉淀后应用70 的乙醇洗涤 以除去盐离子等 晾干DNA 让乙醇充分挥发 不要过分干燥 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2 或Mn2 离子 抑制DNase pH
12、值为8 0 可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 1 DNA中含有蛋白 多 糖 多酚类杂质 2 DNA在溶解前 有酒 精残留 酒精抑制 后续酶解反应 3 DNA中残留有金属离 子 1 重新纯化DNA 去除蛋 白 多糖 多酚等杂 质 具体方法见前 2 重新沉淀DNA 让酒精 充分挥发 3 增加70 乙醇洗涤的 次数 2 3次 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一 DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应 原 因 对 策 1 材料不新鲜或反复冻 融 2 未很好抑制内源核酸 酶的活性 3 提取过程操作过于剧 烈 DNA被机械打断 4 外源核酸酶污染 5 反复冻融 1 尽
13、量取新鲜材料 低温保存材料避 免反复冻融 2 液氮研磨或匀浆组织后 应在解冻 前加入裂解缓冲液 3 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时 可增加裂解液中螯合剂 的含量 4 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5 所有试剂用无菌水配制 耗材经高 温灭菌 6 将DNA分装保存于缓冲液中 避免 反复冻融 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题二 DNA降解 对 策 原 因 1 实验材料不佳或量少 2 破壁或裂解不充分 3 沉淀不完全 4 洗涤时DNA丢失 1 尽量选用新鲜 幼嫩 的材 料 2 动植物要匀浆研磨充分 G 菌 酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 3 高温裂解时 时间适当延长 对
14、于动物细胞 细菌可增 加PK的用量 4 低温沉淀 延长沉淀时间 5 加辅助物 促进沉淀 6 洗涤时 最好用枪头将洗涤 液吸出 勿倾倒 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题三 DNA提取量少 对 策 原 因 1 2 RNA的提取与纯化 细胞RNA的含量 每个细胞的RNA量约为10 5 g 80 85 rRNA 10 15 tRNA 1 5 mRNA 其他RNA hnRNA snRNA snoRNA 液氮中研磨 加蛋白变性剂 去除DNA和蛋白 提供超低温抵制酶活性 异硫氰酸胍 N 十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分离 异硫氰酸胍 巯基乙醇抑制RNase活性 LiCl2沉淀RNA 酚仿或水饱和酚
15、抽提DNA和蛋白 将RNA留水相中 乙醇洗涤杂质 乙醇或异丙醇沉淀RNA 纯化和沉淀RNA q 异硫氰酸胍 苯酚法 原理 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解 同时核蛋白体上的蛋白变 性 核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体 系中的中间相和水相 从而得以分离 有机溶剂抽提 沉淀 得到纯净RNA 步骤 材料准备 尽量新鲜 器具准备 0 1 DEPC处理24小时 灭菌 裂解变性 异硫氰酸胍 亚硫氢胍 巯基乙醇 N 月桂肌氨酸等 使细胞及核蛋白复合物变性 释放RNA 有效抑制核酸酶 纯化分离 苯酚 氯仿 异戊醇 苯酚 氯仿可抽提去除杂物 洗涤 70 乙醇 沉
16、淀 异丙醇 无水乙醇 乙酸钠 pH4 0 维持变性的细胞裂解液的pH值 沉淀RNA 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA 影响影响RNARNA提取的因素提取的因素 q 材料 新鲜 切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难 且实验需要一定的时间间隔 可以先将材料 贮存在TRIzol或样品贮存液中 于 70 或 20 保存 如要多次提取 请分成多份保存 液氮长期保存 70 短期保存 q 样品破碎及裂解 根据不同材料选择不同的处理方法 培养细胞 通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌 一般TRIzol可直接裂解 对于一些特殊的材料可先 用酶或者机械方法破壁 动植物组织 先液氮研磨和匀浆 后加裂解液裂解 期间动作快 速 样品保持冷冻 样品量适当 保证充分裂解 为减少DNA污染 可适当加大裂解液的用量 q 纯化 在使用氯仿抽提纯化时 一定要充分混匀 且动作快速 经典的纯化方法 如 LiCl 沉淀等 虽然经济 但操作时间长 易造成 RNA 降解 柱离心式纯化方法 抽提速度快 能有效去除影响 RNA 后续酶反 应的杂质 是目前较为理想的选择 影响影响RNARNA提取的因素提取的因素 1 3 核酸的纯度与浓度鉴
