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1、 微生物遗传部分 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 2 2 实验四 T4噬菌体基因组rII 区域不同基因突变的互补 导 语 T4是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体 其基因组 是双链线性DNA分子 约有1 7x105碱基对 编码的蛋白 质超过135种 T4基因组的两端具有约3 6kb的正向重复 序列 全长比其头部长650倍 意味着T4 DNA是高度螺 旋 紧密折叠地装配在头部中 T4基因组rII区域有2个基 因rIIA和 rIIB 这2个基因突变均表现为快速溶菌 这种快 速溶菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性 突变型若感染E coli C菌株 可以形成大而透明
2、的噬菌斑 因此将E coli C菌株称为受纳性寄主 突变型若感染 E coli K菌株 则不能复制其DNA 因此不能形成噬菌斑 因此将 E coli K菌株称为限制性寄主 S Benzer巧妙地利 用这一特点设计了经典的互补实验 首次证明顺反子 Cistron即基因 是一个必须保持完整才具有正常生理功 能的遗传物质最小的功能单位 一个基因或一个顺反子是 一个完整的结构 所以属于同一基因的两个突变型不能互 补 如果两个突变型能够互补 就说明它们属于不同的基 因突变 影响的不是同一功能 导 语 T4噬菌体是一类专性寄生的原核生物 只能在寄主细胞内繁殖 噬菌体比细菌繁 殖速度快得多 典型的细菌一般在
3、30min 内由1个变为2个 而1个T4噬菌体在相同 的时间内可以形成将近100个左右的子代 噬菌体 因此2h后当细菌和噬菌体都繁殖 了4代时 细菌的数目是24 16 而噬菌 体的数目却是1004 108 导 语 自从1917年发明在平板上观察噬菌斑 plaque 的方法后 一直延续至今 噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的 多少 100个细菌在平板上会形成100个菌落 若108个细 菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层 称为 lawn 为使菌体能形成均匀的一层 首先将细菌混合在少量热的 液体琼脂中 然后倒在固体平板的上层 这一液体琼脂称 为Top agar或 Soft agar 它会迅速凝固
4、形成一个光滑的表 层 细菌在这一薄层中会长得非常均匀 如果有1个噬菌体 存在 它将会感染细菌 随后被感染的细菌裂解后释放100 200个子代噬菌体 它们又去感染附近的细菌 如此延续 下去几个小时 噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃光 在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞 称为plaque 因为 1个噬菌体形成1个plaque 故噬菌体的浓度便可以计算出 噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位 表示 PFU mL 一 实验目的 通过实验了解基因互补的原理 并确定几 个T4快速溶菌突变型是否属同一基因突变 二 实验原理 将2个不同的T4 rII突变型共同感染限制性寄主E coli K菌株 若2个突变的噬菌体
5、不是影响相同的功能 则可表现互补使其 各自的DNA在E coli K菌株中得以复制 在复制过程中相互重 组 进而形成了野生型的噬菌体 野生型的噬菌体经反复感染 和裂解限制性寄主 便可形成清晰的噬菌斑 将一系列表型相同的rII突变型 双双混合感染限制性宿主进行 互补实验 全部 rII突变型可以区分为 rIIA和rIIB两个互补群 同属于rIIA或rIIB的两个突变型在混合感染中没有互补作用 任何一个rIIA突变型和任何一个rIIB突变型在混合感染中都 有互补作用 使表型恢复正常 一系列rIIA突变型在染色体上 所占的区域称为顺反子A 一系列rIIB突变型在染色体上所占 的区域称为顺反子B 由于r
6、II突变型均为点突变 故实验中必 须要有检测回复突变的对照 三 实验材料和用具 菌种 E coli C 受纳性寄主 和 E coli K 限制性菌株 过夜培养物 T4 rII突变型26 28 29 点样浓度为 1x108 ml 倒平板浓度为1x109 ml HA平板9块 效价测定用5块 HSA试管 3mL x 9只 20 l 200 l移液器各一支 Tip 48 oC水浴 四 实验方法和内容 一 噬菌体T4裂解液的制备 1 双层平板法制备裂解液 1 将E coli C接种3mL HB中 37 震荡培养5 6小时 2 制备HA平板 待凝固后置50 烘30分钟备用 3 取小试管一只 加0 5mL菌
7、悬液 加0 2mL浓度为105 106的 T4储存液 再加入3mL 50 左右的HSA 软琼脂培养 基 混合均匀后倒在HA平板上层 凝固后37 培养过夜 4 用涂棒 将HA平板上层软琼脂刮入离心管 加入3mL HB 静置30分钟 加2 3滴氯仿 剧烈震荡半分钟 5 4000 rpm 离心15 min 取出上清液 加几滴氯仿 4 冰箱保存备用 一 噬菌体T4裂解液的制备 2 液体法制备裂解液 1 将E coli C 接种3mL HB中 37 震荡培养2 3小时 2 加入1 体积的 T4储存液 或单噬 斑1个 继续震荡培养5小时 一般应测 OD600 值 当OD值下降又回升时停止培 养 3 加2
8、3滴氯仿 震荡半分钟 4000rpm离心15分钟 取上清液加几滴氯 仿 置4 冰箱保存备用 二 裂解液效价测定 将E coli C 接种3mL HB中 37 震荡培养5小时 制备HA平板 待凝固后置50 烘30分钟备用 将T4裂解液依次稀释至10 7 取一只小试管 加入0 2mL E coli C 加入T4裂解 液0 1mL 10 6 10 7 每个稀释度两只试管 再加入2 5mL HAS 50 左右 混合均匀后迅 速倒在HA平板上层 凝固后 37 倒置培养 培养6小时后 便可以计数噬菌斑 计算裂解液效 价 检测回复突变 取一只小试管 加入0 2mL E coli K 加入T4裂解液0 1mL
9、 10 5 再加入2 5mL HAS 50 左右 混合均匀后迅速倒在HA平板 上层 凝固后 37 倒置培养 三 互补实验 1 取E coli K 接种于HB培养基 37oC 180rpm振荡培养过夜 2 首先制备好4块HA平板 将装有HSA 软琼脂 的试管置于48oC水浴保温 3 在每一HA平板的底部预先标记好以下内 容 No phage 26X 28X 29X 三 互补实验 4 在每支HSA试管中加0 2ml E coli K过夜培养物 5 将第一支HSA试管倒到 无噬菌体 的平板上 用做 回复突变的对照 6 往第二支HSA试管中加0 1ml rII 26 1x109 mL 混 合好后倒 2
10、6x 平板 其它的噬菌体均以相同的方 式倒好平板 7 将噬菌体26 28 29分别进行10倍稀释 8 用接种环或用移液器吸取3 5 l各种稀释后的噬菌 体悬液 1x108 ml 小心点到每一平板相应的 位置上 实验注意事项 点样时应小心勿将琼脂划破 各种噬菌体的点样位点必须有一 定间隔 防止连成片不易分析结 果 点完样后不要立即翻动平板 待 所点样品完全干后 再倒置平板 培养 五 实验报告 一 实验结果用 或 表示 如点样位置 上有较多的噬菌斑则为 无噬菌斑则为 但要与对照平板比较 检查每一 rII突 变型单独感染K菌株是否形成噬菌斑 记 录下观察的实验结果 二 分析各T4噬菌体基因组rII突变型的 基因互补关系 依据实验结果确定噬菌体 26 28分别为哪一基因突变 六 思考题 1 互补实验的意义 2 两个不同基因突变的T4噬菌 体所发生的互补是基因产物 的互补 为什么发生互补后 会形成野生型的T4噬菌体
