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1、PGS 精细化操作流程 MDA 法全基因组扩增(注:为避免 DNA 污染,需在超净工作台中操作,操作前紫外杀菌 30min使用无菌 耗材,且使用带滤芯的吸头)1、准备 Buffer DLB:将 Buffer DLB 管离心使干粉聚集到管底,加 500l 无核酸酶水,Vortex 彻底混匀使其溶解 ,短暂离心( 溶解后 BufferDLB 可在-20C 保存 6 个月)2、准备 Buffer D2:(下表为配制 12 个反应,-20C 可保存 3 个月)Component Volume1M DTT 3 lBuffer DLB 33lTotal 36 l3、将细胞样本离心,使其离心至管底,用 PB
2、S 补至 4l4、加 3l Buffer D2,手指轻轻拨动 PCR 管混匀,瞬时离心 (注:加反应液时枪头不要碰到细胞样本以免带走细胞细胞样本液一般为 1-2l)5、PCR 仪上 65C 孵育 10min,【程序设 MDA1】加热盖(热盖温度可设为 90C)取出时放冰上.6、反应完成后立马加 3l Stop Solution,手指轻轻拨动 PCR 管混匀,瞬时离心,放冰上7、冰上融化 REPLI-g sc DNA Polymerase(最后加入),其余组分室温融化后 vortex混匀,瞬时离心后放置冰上按照下表配制反应:(注:Reaction Buffer 解冻后可能会有沉淀,Vortex
3、约 10s 使其彻底溶解后用)8、 上述反应液混匀后取 40l 加入步骤 6 的 10l DNA 中,混匀,瞬时离心9、 PCR 仪上 30C 孵育 8h(热盖温度为 70C)10、 PCR 仪上 65C 孵育 3min 使酶失活【程序设 MDA2】11、扩增产物 4C 短期保存 ,若长期保存则置于-20C 。Component VolumeH20 sc 9lREPLI-g sc Reaction Buffer 29 lREPLI-g sc DNA Polymerase 2 lTotal 40l PGS 精细化操作流程 MDA 产物纯化( Wizard SV Gel and PCR Clean
4、-Up System)1、 加 50l Membrane Binding Solution 于 50l MDA 产物中, vortex 后轻甩室温放1min,12000rpm 1 min2、 加 700l Membrane Wash Solution,12000rpm 1min，弃液倒扣，注意不要交叉污染样本。3、 加 500l Wash Solution,12000rpm 1min4、 12000rpm 空转 2min 弃净多余液体,室温晾干 3min5、 加 50l 无核酸酶水至离心柱膜上,将离心柱换到新的 EP 管上，室温放置 5min后 12000rpm 离心 1min,收集产物 DN
5、A纯化后的产物检测1、浓度:取 2l 稀释至 20l,再取 2l 用 Qubit 方法测浓度。2l 样本： 198l 工作液； 标准品 10l：190l 工作液 （工作液 1l 染料:199lbuffer/样本）标准品 1#和 2#均需要配置。静置 3min 后测浓度。2、 5 对引物检测 PCR 反应体系：名称 体积2PCR Master Mix 12.5lPrimer Mix 8l模板 无法定浓度到 60-180ng/l 每个样本取0.5l水 4l模板Total 25l5 对引物检测 PCR 反应条件：【 】反应温度 反应时间 循环数95C 5min 195C 30s60C 30s72C
6、30s4072C 10min 14C - Hold3、电泳:3%琼脂糖凝胶电泳检测,上样量约为 10l 样本+3l loading buffer 120V 15min。 (5 条带为标准，3 条带亦可上机测序)。PGS 精细化操作流程 文库构建(用 life Tech 的 Ion Xpress Library Kit )一、DNA 片段化:1、 DNA 起始量为 120ng,取适量体积 DNA 于 PCR 管中,补水至 35l2、 Ion Shear plus 10X Reaction Buffer 和 Enzyme Mix II Vortex 混匀各 5s,瞬时离心后放置冰上3、 加 5l
7、10X Reaction Buffer 于 PCR 管中,吹吸 10 次左右混匀4、 加入 10l EnzymeMix II,吹吸混匀,手指轻轻拨动混匀5、 PCR 仪上,37C 孵育 35min【】( 注意:严格控制反应时间)6、 孵育后立即加入 5ul Stop Buffer,vortex 彻底混匀 ,瞬时离心后置于冰上二、纯化1、取出 XP 磁珠充分混匀并平衡到室温，取 1.5ml EP 管加 99l XP 磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育 5 min，离心 2s。2、磁吸 34min,弃上清。3、加 500l 新鲜配制 70%乙醇,磁力架上旋转 2 周约 30s,
8、弃上清4、重复步骤 3室温晾干（观察，若转动 EP 管磁珠不再移动即已晾干） 。5、加 25l low TE，Vortex 5s，静置 30s,瞬离，磁吸 3min，吸 25l 上清至0.2ml PCR 管中。三、连接头注意：一次只能打开一管 barcode，避免交叉污染，体系中酶最后加含 barcode 文库的反应体系Component VolumeDNA 25l10X Ligase Buffer 10lIon P1 Adapter 2 lIon Xpress Barcode X 2ldNTP Mix 2 lNudease-free Water 49lDNA Ligase 2lNick Re
9、pair Polymerase 8lTotal 100lPGS 精细化操作流程 配好体系后吹吸混匀,放入 PCR 仪,反应程序如下: 【 】25C 15min72C 5min4C Hold四、纯化1、取出 XP 磁珠充分混匀并平衡到室温，取新的 1.5ml EP 管加 180l XP 磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育 5 min，离心 2s。2、磁吸 34min,弃上清。3、加 500l 新鲜配制 70%乙醇,磁力架上旋转 2 周约 30s,弃上清4、重复步骤 3室温晾干（观察，若转动 EP 管磁珠不再移动即已晾干） 。5、加 20l low TE，Vortex 5s，静
10、置 30s,瞬离，磁吸 3min，吸 25l 上清至0.2ml PCR 管中。(注:此步骤完成后若不立即进行后续实验可放入-20C 短期保存)五、片段选择(使用 E-GelSizeSelect 2% Agarose Gel) 1、准备好 E-GelSizeSelect 2% Agarose Gel 和 iBase unit 连接好电源,取出胶上的梳子后放好位置，选择“SizeSelectTM2%”程序，调整时间为 16min2、样本上样 20ul，Marker 上样 10ul，按照下表位置点样:（孔 1、8 不推荐点样，为避免收集的产物浓度不够）Marker 为 50bp Ladder 工作液
11、(即用 lowTE 将 50bpLadder 原液稀释 40 倍而成)Marker 片段大小 为 50bp100bp150bp200bp250bp300bp350bp (主带) 4003、按“Go”开始电泳在电泳进行至约 11 min 时,再次按“Go”暂停,向第二排 2-7孔 (除 M)补 10ul 水后,按“Go”继续4、电泳进行至约 13-14 min 时,Marker 的 200 bp 条带在收集孔中,此时收集液体，再用 10l 水洗收集孔,两次加一起共约 25ul胶孔 1 2 3 4 Marker 5 6 7 8第一排 25l 水 样品 1 样品 2 样品 3 10ul 样品 4 样
12、品 5 样品 6 25l 水20ul 20ul第二排 25l 水 25l 水 25l 水 25l 水 10ul 水 25l 水 25l 水 25l 水 25l 水PGS 精细化操作流程 2、 PCR 扩增室温解冻 PCR Reaction mix 和 Primermix,轻轻 vortex 混匀,瞬时离心,使管壁附着液滴离心至管底,放置于冰上制备 PCR 反应液(冰上),体系如下：Component VolumeUnamplified library 25 lPlantinum PCR SuperMix High Fidelity 100lLibrary Amplification Prime
13、r Mix 5lTotal 130l反应体系加好后,轻微 Vertex 混匀,瞬时离心,使管壁附着液滴离心至管底放入 PCR 中反应,程序如下:【 】3、纯化1、取出 XP 磁珠充分混匀并平衡到室温，取新的 1.5ml EP 管加 195l XP 磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育 5 min，离心 2s。2、磁吸 34min,弃上清。3、加 500l 新鲜配制 70%乙醇,磁力架上旋转 2 周约 30s,弃上清4、重复步骤 3室温晾干（观察，若转动 EP 管磁珠不再移动即已晾干） 。5、加 20l low TE，Vortex 5s，静置 30s,瞬离，磁吸 3min，吸
14、25l 上清至已备好的装有 30l XP 磁珠的 1.5ml EP 管中，Vortex 5s，室温孵育 5 min，离心2s。6、磁吸 34min,弃上清。7、加 500l 新鲜配制 70%乙醇,磁力架上旋转 2 周约 30s,弃上清Step Temperature Time Cycle1 95 C 5 min 195 C 15 s58 C 15 s270 C 1 min83 4 C Holding -PGS 精细化操作流程 8、重复步骤 3室温晾干（磁珠量很少，吸尽上清之后已经干燥可直接洗脱） 。9、加 20l low TE 洗脱， Vortex ，充分振匀，尽量多振。静置 30s，瞬离，磁吸，吸 20l 上清至新的 1.5ml EP 管中。 （若不进行后续实验，可放入-20C 保存）六、文库检测Qubit 方法检测文库浓度（方法同前）
