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1、7 发酵工艺控制 n微生物工程的工业生产水平由3个要素 生产菌种的性能 发酵工艺 生产设备 n控制发酵工艺的目的 使生产菌种处于最佳的产物合成条件下 温度 pH 氧 CO2 泡沫 7 1 温度对发酵的影响及其调节控制 微生物与温度的关系 1 通常在生物学范围内每升高10 生长速度就加快一倍 2 机体的重要组成如蛋白质 核酸等都对温度较敏感 3 任何微生物的生长都需要有最适的生长温度 4 如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁 殖 对生产来说 即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备 一 温度对生长的影响 不同微生物的生长对温度的要求不同 根据它们对温度的要求 大致可分为四
2、类 嗜冷菌适应于0 260C生长 嗜温菌适应于15 430C生长 嗜热菌适应于37 650C生长 嗜高温菌适应于650C以上生长 二 温度对发酵的影响与控制 一 温度对发酵的影响 1 温度影响反应速率 细胞生长 产物形成 发酵过程的反应速率实际是酶反应速率 酶反应有一个 最适温度 从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr dt E RT2 积分得 E 活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响 E 活化能 Kr 速率常数 青霉菌 生长 E 34 kJ mol 呼吸 E 71 kJ mol 产物合成 E 112 kJ mol 青霉素形成速率对温度最为敏感 偏离最适 温度引起的生产率下降比其他两个参数的
3、变 化更为严重 2 温度影响发酵液的物理性质 温度影响基质溶解度 氧在发酵液中的溶解度 影响菌 对某些基质的分解吸收 影响氧在发酵液中的溶解度 温度 溶氧 影响基质的分解速率 如菌体对硫酸盐吸收在25 时最小 3 温度影响生物合成的方向 金色链丝菌 金霉素 四环素 小于30 大于35 举例 4 温度可能会影响终产物的质量 例如 苏云金杆菌的发酵 一般在30 31 进行 这样形成的晶体毒力强 若发酵温度提高到 37 以上 虽然菌体生长繁殖较快 最终含 菌数也较高 但生物毒力较低 直接影响产 品的质量 三 发酵过程引起温度变化的因素 一 发酵热Q发酵 l发酵热是引起发酵过程温度变化的原因 l所谓发
4、酵热就是发酵过程中释放出来的净热量 在发酵过程中生产菌分解基质产生热量 机械搅拌产生热量 而罐壁散热 水分蒸发 空气排气带走热量 各种产生的 热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量 l发酵热引起发酵液的温度上升 发酵热大 温度上升快 发 酵热小 温度上升慢 nQ发酵 Q生物 Q搅拌 Q蒸发 Q显 Q辐射 发酵热指的是发酵过程中释放出来的净 热量 以J m3 h 为单位表示 1 生物热Q生物 生物热 生产菌在生长繁殖过程中产生的热 叫生物热 能量分流 1 部分用来合成高能化合物 供微生物合成和 代谢活动的需要 2 部分用来合成产物 其余部分则以热的形式 散发出来 n 生物热产生有强烈的阶段性
5、影响生物热的因素 菌株对营养物质利用的速率越大 培养基成分越丰富 生 物热也就越大 发酵旺盛期的生物热大于其它时间的生物热 四环素20 50小时 苏云金杆菌10 18小时 1 菌种特性 2 培养基 成分及配比 3 发酵阶段 4 搅拌类型及搅拌速度 5 通气速度 影响Q蒸发和Q显 6 罐内外的温差 2 搅拌热Q搅拌 n搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间 的摩擦所产生的热能 n搅拌热与搅拌轴功率有关 可用下式计算 n Q搅拌 P V 3600 3 蒸发热Q蒸发 通气时 空气带走一部分水蒸气 被排出的水蒸气和空 气夹带着部分显热散失到罐外的热量叫蒸发热 Q蒸发 G I出 I进 4 辐射热Q辐射
6、 由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热 能通过罐体向大气辐射的热量 辐射热的大小取决于罐温与环境的温差 冬天大一些 夏天小一些 一般不超过发酵热的5 5 显热 Q显 排出气体所带的热 二 发酵热的测定 方法一 通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出口温 度 由下式求得这段时间内的发酵热 Q发酵 GC t2 t1 V J m3 h G 冷却水流量 kg h C 水的比热 J kg t 1 t 2 进 出口的冷却水温度 V 发酵液体积 m3 方法二 n 通过罐温的自动控制 先使罐温达到恒定 再关闭自动控制装置测得温度随时间上升的速率 S 按下式可求得发酵热 Q发酵 M1c1 M2
7、c2 S M1 c1 发酵液质量 比热 M2 c2 发酵罐质量 比热 S 温度上升速率 温度的控制 方法 罐壁调温 夹层调温 罐内调温 四 最适温度的选择 最适发酵温度 是指最适于某种生产菌的生长 或产物合成的温度 对于不同的菌种 不同的培养条件 不同的酶 促反应及不同的生长阶段 最适温度有所不同 n微生物种类不同 所具有的酶系及其性质 不同 所要求的温度范围也不同 n如黑曲霉生长温度为37 n谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30 32 n青霉菌生长温度为30 1 根据菌种选择 发酵前期由于菌量少 发酵目的是要尽快达到大量的菌体 取稍 高的温度 促使菌的呼吸与代谢 使菌生长迅速 中期菌量已达到
8、合成产物的最适量 发酵需要延长中期 从而提 高产量 因此中期温度要稍低一些 可以推迟衰老 后期 产物合成能力降低 延长发酵周期没有必要 就又提高温 度 刺激产物合成到放罐 2 根据生长阶段选择 例 青霉素变温发酵 n青霉素产生菌的最适生长温度是30 而最适于青 霉素合成的温度是24 7 n青霉素发酵的温度控制 n0 5h 30 C n6 35h 25 C n36 85h 20 C n86 125h 25 C 0 53585125 30 25 20 25 利用计算机模拟确定最佳发酵条件 正逐步得 到推广应用 根据模拟计算机对发酵温度最佳点的计算 得到青霉素发酵的最适温度是 起初5h维持在30 随
9、后降到25 培养35h 再降到20 培养85h 最后回升到25 培养 40h放罐 采用这种变温培养 比在25 恒温培养青 霉素产量提高15 3 根据培养条件选择 温度选择还要根据培养条件综合考虑 灵活选择 通气条件差时可适当降低温度 使菌呼吸速率降低 些 溶氧浓度也可髙些 培养基稀薄时 温度也该低些 因为温度高 营养 利用快 会使菌过早自溶 4 根据菌生长情况 菌生长快 维持在较高温度时间要短些 菌生长慢 维持较高温度时间可长些 培养条件适宜 如营养丰富 通气能满足 那么前 期温度可髙些 以利于菌的生长 发酵过程温度控制另一生产事例发酵过程温度控制另一生产事例 例如 在四环素的发酵过程中 采用
10、变温 控制 在中后期保持一个较低的温度以延长抗 生素分泌期 放罐前24小时提高2 3 这能 使最后24小时抗生素产量提高50 7 2 pH对发酵的影响及控制 微生物生长和生物合成的最适pH 大多数细菌生长的最 适pH6 3 7 5 霉菌最适生长 pH3 6 放线菌生长最适 pH7 8 微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不一样 这 不仅与菌种的特性有关 也取决于产物的化学性质 产品菌生长最适pH范 围 产物合成最适pH范 围 青霉素6 5 7 26 2 6 8 链霉素6 3 6 96 7 7 3 四环素6 1 6 65 9 6 3 土霉素6 0 6 65 8 6 1 红霉素6 6 7 0
11、6 8 7 3 灰黄霉素 6 4 7 06 2 6 5 几种抗生素发酵的最适pH范围 1 pH影响酶的活性 当pH值抑制菌体某些酶 的活性时使菌的新陈代谢受阻 2 pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变 从而 改变细胞膜的透性 影响微生物对营养物质的吸收及 代谢物的排泄 3 pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的利用 7 2 1 pH对发酵的影响 4 pH影响代谢方向 pH不同 往往引起菌体代谢过程不同 使代谢产物的质量和比例 发生改变 例如黑曲霉在pH2 3时发酵产生柠檬酸 在pH近中性时 则产生 草酸 谷氨酸发酵 在中性和微碱性条件下积累谷氨酸 在酸性条件下 则容易形成谷氨酰胺和N 乙酰谷氨
12、酰胺 5 pH影响菌体的形态 pH值会影响某些霉菌的形态 如细胞壁厚度 菌丝直径 例 培养基初始pH值对漆酶分泌的影响 pH在4 7范围内产酶最高 6 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响 例 青霉素 菌体生长最适pH3 5 6 0 产物合成最适pH7 2 7 4 四环素 菌体生长最适pH6 0 6 8 产物合成最适pH5 8 6 0 生长 合成 X pH 7 2 2 影响发酵pH的因素 1 基质代谢 1 糖代谢 特别是快速利用的糖 分解成小分子酸 醇 使pH下降 糖缺乏 pH上升 是补料的标志 之一 2 氮代谢 当氨基酸中的 NH2被利用后pH会 尿素被分解成NH3 pH NH3利用后pH
13、 当碳源 不足时氮源当碳源利用pH上升 3 生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降 2 产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性 使发酵液pH变化 如有 机酸类产生使pH 红霉素 洁霉素 螺旋霉素等抗 生素呈碱性 使pH 3 通气条件变化 菌体自溶或杂菌污染都可 能引起发酵液pH变化 7 2 3 最适pH的选择和调节 请问选择最适pH的原则是什么 n最适pH的选择和调节的原则 n既有利于菌体的生长繁殖 又可最大限度的获得高产 n根据不同微生物的特性 在发酵过程中随时检查pH 值的变化 选用适当的方法进行调节 n生长最适pH和产物形成最适pH的相互关系 两者相同 范围都宽 容易控制 两者相同 范围一宽一
14、窄 必须严格控制 两者相同 范围都窄 必须严格控制 两者不同 范围都窄 分别严格控制 四种类型 四种类型应分别怎样进行发酵控制 补料 恒速补料 按需补料 n选择pH值的方法 通过实验确定 配制并始终调节控制不同pH 检出菌体或产物最大值 pH对产海藻酸裂解酶的影响 调节pH值的方法 1 在基础培养基配方中考虑到维持pH的需要 例如加入CaCO3 使用缓冲液等 2 通过补加酸 碱来调节控制 3 通过中间补料来控制 如 青霉素生产的葡萄糖补加控制如 青霉素生产的葡萄糖补加控制pHpH n氧是制约发酵进行的重要因素 n氧难溶于水 培养基中贮存的氧量很少 纯氧溶纯水 1 26mmol L 空气氧溶纯水
15、 0 25 培养基更低 n高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短加剧了对 氧的需求 n形成产物的最佳氧浓度和生长的最佳氧浓度有可 能是不同 的 n发酵罐中氧的吸收率很低 多数 2 通常 1 n加大通气量会引起过多泡沫 n消泡剂不利于氧的溶解 7 3 溶解氧浓度对发酵的影响 7 3 1氧的传递和传质方程式 一 氧的传递途径及传质阻力 n供氧 空气中的氧从空气泡里通过气膜 气液界面 和液膜扩散到液体主流中 n耗氧 氧自液体主流通过液膜 菌体丛 细胞膜扩 散到细胞内 整个过程必须克服一系列的阻力 才 能被微生物利用 n由于氧是很难溶于水中的气体 所以在供氧方面液 膜阻力比较显著 是控制因素 n氧
16、从空气泡到达细胞的总传递阻力为上述各阻力之和 n氧传递的总推动力是 n氧传递的总推动力 气相与细胞内的氧分压差和浓度差 n减小阻力方法 液膜 气液混合所生湍动 细胞团内阻力和壁阻力 搅拌减少逆向扩散梯度 二 气液相间的氧传递和氧传质方程式 当气液传递过程处于稳态时 通过液膜和气膜的传递 速率相等 即 在稳定情况下 氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递 速率即氧的传质方程式 OTR KLa C CL 式中 OTR 单位体积培养液中的氧传递速率 mol m3 s n KL 容积传递系数 n 比表面积 n KL 以氧浓度为推动力的总传递系数 n C 气液平衡的液相氧浓度 n CL 液相主体氧浓度 n充裕的通气情况下 C CL n不充裕的通气情况下 C CL n 培养物处于充裕的通气情况下 CL会逐渐 接近C 氧传递速率渐小 n 而处于不充裕的通气情况下 CL下降趋于 0 氧传递速率最大 C CL 推动力 7 3 2 影响微生物对氧需求的因素 一 相关概念 比耗氧速率 呼吸强度 单位质量的细胞在 单位时间内消耗氧的量 K0 氧的米氏常数 mol m3 n各种菌的K0和 QO2 m有定值 表7
