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1、 PCR技术 一 聚合酶链式反应 PCR 概述 一 概念 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaciton PCR 即PCR技术 是近年来发 展起来的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法 二 发展历程 1971年 Kjell Kleppe提出PCR原始雏形 概念 1983年 Kary Mullis发明PCR技术 1987年 获得专利 1993年 诺贝尔化学奖 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制 过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物 PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤 构成 二 PCR反应的原理和步骤 1 模板DNA的变性 模板DNA经加
2、热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以 便它与引物结合 为下轮反应作准备 2 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA 经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 3 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为 模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条 新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获 得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可 成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4分 钟 2 3小时就能将待扩目的
3、片段富集106 109倍 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 变性 94度 引物 退火 55度 延伸 72度 DNA聚合酶 dNTP 变性 退火 引物 经25 30次循环 目的DNA增加106 9 PCR反应过程示意图 Y Y0 1 X n Y 扩增拷贝数量 Y0 起始模板数量 X 扩增效率 n 扩增循环数 PCR 理论方程 三 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行 使DNA扩增量 呈指数上升 平均扩增效率的理论值为100 但 在实际反应中平均效率达不到理论值 反应初期 靶序列DNA片段的增加呈指数形式 随着PCR产 物的逐渐积累 被扩增的DNA片段不再呈指数增加 而进入线性增长期
4、或静止期 即出现 停滞效 应 这种效应称平台期 四 PCR反应体系的主要成分和作用 lDNA聚合酶 l模板 l引物 ldNTP l缓冲体系 一 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌的重组体 与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活 性 可分为两大类 1 具有校正功能的 有3 5 核酸酶活性 比如 Vent pfu pwo等 2 不具有校正功能的 无3 5 核酸酶活性 比如 一般的Taq DNA聚合酶 二 模板 核酸模板的量与纯化程度 是PCR成败与否 的关键环节之一 传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本 一般临床检测标 本 可采用快速简便的方法溶解细胞
5、裂解病原 体 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离 直 接用于PCR扩增 RNA模板提取一般采用异硫氰酸 胍或蛋白酶K法 要防止RNase降解RNA 三 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR产物的特 异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上 只要知道任何一段模板DNA序列 就能按其设计互 补的寡核苷酸链做引物 利用PCR就可将模板DNA 在体外大量扩增 设计引物应遵循以下原则 1 引物长度一般15 30个bp 常用为20bp左右 引 物过短过长都会使特异性降低 2 引物扩增跨度以200 500bp为宜 特定条件下可 扩增长至10kb的片段 3 引物碱基G C含量以40 60 为宜 G
6、C太少扩增效 果不佳 G C过多易出现非特异条带 碱基随机分 布 避免5个以上的相同核苷酸的成串排列 4 避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互 补 特别是3 端的互补 否则会形成引物二聚体 产生非特异的扩增条带 5 引物3 端的碱基 特别是最末及倒数第二个碱 基 应严格要求配对 以避免因末端碱基不配对 而导致PCR失败 6 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的 靶序列最好有适宜的酶切位点 这对酶切分析或 分子克隆很有好处 7 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性 引物量以最低引物量产生所需要的结果为 好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增 且可增加引物之间形成二聚体的机会
7、 四 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关 系 在PCR反应中 dNTP应为50 200umol L 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等 等摩尔配制 如其中任何一种浓度不同于其它几种时 偏高 或偏低 就会引起错配 浓度过低又会降低 PCR产物的产量 五 PCR反应缓冲液 组成 50mM KCl 10mM Tris Cl pH 8 4 1 5mM MgCl2 Mg2 是Taq酶活性所必需的金属离子 dNTP 能与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度降低 Mg2 浓 度过高 反应特异性降低 出现非特异扩增 浓 度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性 使反应产 物减少 六
8、 PCR反应标准体系 五 PCR的反应条件控制 一 PCR反应的温度和时间控制 1 变性温度与时间 变性温度低 解链不完全是导致PCR失败的 最主要原因 一般情况下 93 94 lmin足 以使模板DNA变性 若低于93 则需延长时间 但温度不能过高 因为高温环境对酶的活性有 影响 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全 变性 就会导致PCR失败 2 退火 复性 温度与时间 退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组 成及其浓度 还有靶基序列的长度 引物的复性温 度可通过以下公式帮助选择合适的温度 Tm值 解链温度 4 G C 2 A T 复性温度 Tm值 5 10 在Tm值允许范围内 选择较高
9、的复性温度可大 大减少引物和模板间的非特异性结合 提高PCR反应 的特异性 复性时间一般为30 60sec 足以使引物 与模板之间完全结合 3 延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度一般选择在70 75 之 间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于 引物和模板的结合 PCR延伸反应的时间 可根据待扩增片段的 长度而定 一般1Kb以内的DNA片段 延伸时间 1min是足够的 3 4kb的靶序列需3 4min 扩 增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非 特异性扩增带的出现 对低浓度模板的扩增 延伸时间要稍长些 二 PCR反应的循环次数控制 循环次数决定PCR扩增程度 PCR循环次数 主要
10、取决于模板DNA的浓度 一般的循环次数 选在30 40次之间 循环次数越多 非特异性 产物的量亦随之增多 六 PCR反应的特点 1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的 结合 碱基配对原则 TqDNA聚合酶合成反应的正确度 靶基 因的特异性与保守性 2 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的 3 简便快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶 一次性地将反应液 加好后 即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性 退火 延伸反 应 一般在2 4h完成扩增反应 4 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞 DNA粗制品及总DNA 均可作为扩增模板 可直接用
11、临床标本如血液 体腔液 洗 嗽液 毛发 细胞 活组织等粗制的DNA扩增检测 1 隔离操作 戴不受污染的手套 2 试剂的配制 分装和保存 3 开盖前先离心 小心开盖和上盖 4 加样时最后加模板DNA 5 设立对照实验 6 注意其他操作过程中可能造成的污染 七 防止PCR错误扩增的措施 八 PCR常见问题及解决办法 一 扩增不出特异性带 1 原因 1 引物设计有问题 引物位置错误 引物之间 太强的相互作用 2 反应体系有问题 3 退火温度太高 2 解决办法 1 确认引物正确性 2 用保证能扩增出来的引物验证反应体系 3 采用梯度PCR功能 寻找最适合的退火温度 二 扩增带很弱 1 原因 1 反应体
12、系效率低 2 退火温度太高 3 很多非特异性扩增 4 大量引物二聚物的形成 2 解决办法 1 用已确认的引物验证 2 采用梯度PCR功能寻最适的退火温度 3 采用定量PCR的熔点曲线功能分析 提高退火 温度 改变反应体系的PH值 三 非特异性扩增带很多 1 原因 1 退火温度太低 2 反应体系有问题 2 解决办法 1 采用梯度PCR功能寻找最佳反应温度 2 更换反应体系 四 引物二聚物太多 1 原因 1 引物设计有问题 2 反应体系有问题 3 退火温度太低 2 解决办法 1 重新设计引物 2 调整和更换反应体系 3 用梯度PCR寻找最佳的退火温度 五 结果的重现性差 1 原因 反应体系发生了变
13、化 2 解决办法 用荧光定量PCR仪熔点曲线功能分析PCR的结果 看非特异性产物和引物二聚物 九 常规PCR技术及几类PCR新技术 温度梯度PCR 不对称PCR 热启动PCR 原位PCR Touch down PCR 连接酶链反应 RT PCR RACE PCR 荧光定量PCR AFLP 兼并引物PCR 巢氏PC 免疫 PCR immuno PCR 反向PCR MSP甲基化特异 PCR 一 温度梯度PCR 1 概念 通过对复性温度比引物的Tm值低2 10 的范围内进行系列PCR预实验来对 复性条件进行优化 温度梯度温度梯度PCRPCR 温度梯度曲线 Thermal Image of 45 65
14、 C Gradient across a PTC 200 with a 96 well Alpha 温度梯度PCR优化复性温度 48 C68 C Unoptimized Annealing temperature 50 C Optimized Annealing Temperature 62 6 C Gradient optimization of 12 different temperatures across the block tested between 48 C and 68 C 二 热启动PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外 提高PCR 特异性最重要的方法之一 尽管Taq D
15、NA聚合酶的 最佳延伸温度在72 聚合酶在室温仍然有活性 因此 在PCR反应试剂配制过程中 以及在热循环 刚开始 保温温度低于退火温度时会产生非特异性 的产物 这些非特异性产物一旦形成 就会被有效 扩增 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是 在冰上配制PCR反应液 并将其置于预热的PCR仪 这种方法简单便宜 但并不能完成抑制酶的活性 因此并不能完全消除非特异性产物的扩增 手动热启动法 管底 DNA 预冷buffer dNTP和dH2O 管壁 引物 预热 80 加Taq酶 离心 开始PCR循环 专用热启动酶法 抗体介导的抑制DNA聚合酶法 化学阻断DNA聚合酶法 其他DNA聚合酶抑制剂法 三
16、 Touch down PCR 1 概念 Touch down PCR又称降落PCR 即选定一个 温度范围 如50 35 每降1 2 进行1 2个循 环 然后在50度下进行15个循环 2 原理 随着退火温度的降低 特异性逐步降低 但 特异性条带在温度较高时已经扩增出来 其浓度 远远超过非特异性条带 随着退火温度的降低 特异性条带优先被扩增 3 选择初始复性温度的原则 起始复性温度应该比引物的Tm值高出5 10度 然后每个循环递减1 2度 4 Touch down PCR的应用范围 模板DNA浓度较低 引物简并程度高或特异性低 RT PCR时使用oligo dT 四 RT PCR 1 概念 RNA的多聚酶反应 RT PCR 是以RNA为模板 联合逆转录反应 reverse transcription RT 与PCR 可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10 个拷贝的RNA模板 2 RNA扩增包括两个步骤 1 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下 合 成RNA的互补cDNA 2 加热后cDNA与RNA链解离 然后与另一引物退 火 并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA 最后扩增靶DNA
