发光分析包括荧光磷光化学发光

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1、第6章 分子发光分析 Molecular Luminescence Analysis 6 1 分子荧光及磷光分析 一 基本原理 二 荧光仪器 三 磷光分析 6 2 化学发光分析 一 概述 二 基本原理 三 化学发光的类型 四 化学发光测定仪器 6 3 生物发光简介 6 1 分子荧光分析及磷光分析 分子发光 处于基态的分子吸收能量 电 热 化学和光 能等 被激发至激发态 然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子 此种现象称为发光 发光分析 包括荧光 磷光 化学发光 生物发光等 物质分子吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光 一 基本原理 1 分子能级 荧光及磷光的产生 分子能级 电子能级

2、Ee 振动能级 Ev 转动能级 Er 其中电子能级包含振 转能级 如图 激发三重态 分子吸收能 量 电子自旋不再配对 为三重态 称为激发三 重态 以T1 T2 表示 基态 电子自旋配对 多重度 2s 1 1 为单 重态 以S0表示 激发单重态 分子吸收能 量 电子自旋仍然配对 为单重态 称为激发单 重态 以S1 S2 表示 三重态能级低于单重态 Hund规则 2 去活化过程 Deactivation 处于激发态分子不稳定 通过辐射或非辐射跃迁等去 活化过程返回至基态 这些过程包括 1 振动弛豫 Vibrational Relaxation VR 在液相或压力足够高的气相中 处于激发态的分子因碰

3、 撞将剩余的振动能量以热的形式传递给周围的分子 从而从 高振动能层失活至低振动能层的过程 称为振动弛豫 2 内转换 Internal Conversion IC 对于具有相同多重度的分子 若较高电子能级的低振动 能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时 常发生电子从 高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级 如S2 S1 T2 T1 3 荧光发射 分子电子从单重激发态 Kasha规则 的最低振动能级在很 短时间 10 9 10 6s 跃迁到基态各振动能级时所产生的光子 辐射称为荧光 由于各种去活化过程的存在 荧光辐射能通常 要比激发能量低 或者说 荧光波长大于激发波长 Stokes效 应 4

4、系间跨跃 Intersystem Conversion ISC 系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁 如从 S1到T1 该跃迁是禁阻的 然而 当不同多重态的两个电子能 层有较大重叠时 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发 生变化 即可通过自旋 轨道耦合而产生无辐射跃迁 该过程称 为系间跨跃 5 磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后 再经振动 弛豫回到三重态最低振动能层 最后 在10 4 10s内跃迁到基 态的各振动能层所产生的辐射 6 外转换 External Conversion EC 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧 光或磷光强度减弱甚至消失的过

5、程 也称 熄灭 或 猝灭 3 定性分析 荧光和磷光均属于光致发光 任何荧 磷 光都具有两种特 征光谱 激发光谱与发射光谱 荧 磷 光定性分析的基础 1 激发光谱 通过测量荧光 或磷光 体的发光强度随激发光波长的变化 而获得的光谱 称为激发光谱 具体测绘方法 通过扫描激发单色器 使不同波长的入射光照 射激发荧光 磷光 体 发出的荧光 磷光 通过固定波长的发射 单色器而照射到检测器上 检测其荧光 磷光 强度 最后通过 记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线 即为激发光谱 通过激发光谱 选择最佳激发波长 发射荧光 磷光 强度最 大的激发光波长 常用 ex表示 2 发射光谱 也称荧光光 谱或磷光光谱

6、通过测量荧光 或磷光 体 的发光强度随发射光波长的变化 而获得的光谱 称为发射光谱 其测绘方法 是固定激发光的波 长 扫描发射光的波长 记录发 射光强度对发射光波长的关系曲 线 即为发射光谱 通过发射光 谱选择最佳的发射波长 发射 荧光 磷光 强度最大的发射波长 常用 em表示 磷光发射波长 比荧光来得长 右图为萘的激发 光谱及荧光和磷光的发射光谱 3 激发光谱与发射光谱的特征 i 斯托克斯位移 与激发 或吸收 波长相比 荧光发射波长更长 即产生 所谓Stokes位移 振动弛豫失活所致 ii 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 尽管分子受激可到达不同能级的激发态 但由于去活化 内转换和振动弛豫

7、到达第一电子激发态的速率或几率很大 好像是分子受激只到达第一激发态一样 换句话说 不管激发波长如何 电子都是从电子第一激 发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层 iii 荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中 荧光发射的效率 称为量子产率 与激发 光的波长无关 因此用不同发射波长绘制激发光谱时 激发光 谱的形状不变 只是发射强度不同而已 iV 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 如下图 解释1 能层结构相似性 荧光为第一电子激发单重态的 最低振动能层跃迁到基态的各个振 动能层而形成 即其形状与基态振 动能级分布有关 吸收光谱是由基态最低振动能 层跃迁到第一电子激发单重

8、态的各 个振动能层而形成 即其形状与第 一电子激发单重态的振动能级分布 有关 由于激发态和基态的振动能层 分布具有相似性 因而呈镜像对称 S1 S0 解释2 位能曲线 Frank Condon原理 由于电子吸收跃迁速率极快 10 15s 此时核的相对位置 可视为不变 核较重 当两个能层间吸收跃迁的几率越 大 其相反跃迁的几率也越大 即产生的光谱呈镜像对称 4 影响荧光及荧光强度的因素 产生并可观察到荧光的条件 i 分子具有与辐射频率相应的荧光结构 内因 ii 吸收特征频率的光后 应可产生具一定量子效率的荧光 即量子效率 足够大 kF荧光发射过程的速率常数 ki为其它有关过程的速率常数 的总合

9、可见 凡是使 kF 增加 使其它去活化常数降低的因 素均可增加荧光量子产率 通常 kF 由分子结构决定 内因 而其它参数则由化学环境 外因 和结构共同决定 下面讨论影响荧光及强度的因素 1 跃迁类型 通常 具有 及n 跃迁结构的分子才 会产生荧光 而且具 跃迁的量子效率比n 跃迁的 要大得 多 前者 大 寿命短 2 共轭效应 共轭度越大 荧光物质的摩尔吸收系数越大 荧光越强 3 刚性结构 分子刚性 Rigidity 越强 分子振动少 与其 它分子碰撞失活的机率下降 荧光量子效率提高 如 荧光素 0 92 酚酞 0 芴 1 联苯 0 18 给电子取代基增强荧光 p 共轭 如 OH OR NH2

10、CN NR2等 吸电子基降低荧光 如 COOH C O NO2 NO X 等 重原子降低荧光但增强磷光 如苯环被卤素取代 从氟苯 到碘苯 荧光逐渐减弱到消失 该现象也称重原子效应 这 是因为原子序数高的原子中 电子自旋和轨道运动之间的相 互作用大 增大了系间窜跃速度 4 取代基 溶剂极性可增加或降低荧光强度 改变 及n 跃迁的能量 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光 强度 6 温度 5 溶剂效应 温度增加 荧光强度下降 因为内 外转换增加 粘 度或 刚性 降低 因此体系降低温度可增加荧光分析灵 敏度 9 荧光猝灭 荧光物质与溶剂分子或其他物质的分子的相 互作用引起荧光强度降低的现象

11、称为荧光猝灭 引起荧光强 度降低的物质称为熄灭剂或猝灭剂 荧光猝灭的原因多 机 理复杂 这里只讨论几种类型 8 内滤光和自吸 体系内存在可以吸收荧光的物质 或荧 光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠 均可使荧光强 度下降 称为内滤光 当荧光物质浓度较大时 可吸收自身 的荧光发射 称为荧光自吸 7 pH值 具酸或碱性基团的有机物质 在不同pH值时 其 结构可能发生变化 因而荧光强度将发生改变 对无机荧 光物质因pH值会影响其稳定性 因而也可使其荧光强度发 生改变 碰撞猝灭 主要原因是 当处在单重激发态上的荧光分子M 与熄灭剂Q发生碰撞 使激发态分子以无辐射的跃迁方式回到 基态 产生荧光熄灭作用

12、 这个过程可用下列反应式表示 显然 荧光熄灭程度主要取决于相应反应的速率常数的 相对大小和熄灭剂Q的浓度 静态猝灭 荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基态配合物 从而使荧光猝灭 氧是最典型的荧光猝灭剂 可能是顺磁性的 氧分子与处于单重激发态的荧光分子相互作用 加速荧光物质 激发态分子的系间窜跃导致荧光猝灭 能量转移 熄灭剂与激发单重态的荧光分子作用后 发生 能量转移 使熄灭剂Q得到激发 自熄灭和自吸收 自熄灭指溶液浓度较大时 激发态分子 之间的碰撞引起能量损失 使荧光强度降低 自吸收是指 当荧光物质的吸收光谱与荧光光谱重叠时荧光被溶液中处于 基态的荧光分子吸收 导致荧光强度降低 5 定量分析 荧光

13、强度IF正比于该体系吸收的激发光的光强 I0是入射光的强度 I是入射光通过厚度为b的介质后的光强 常数K 取决于荧光效率 根据比耳定律 代入上式 得 展开上式 得 上式可近似为 若恒定 有 上式表明荧光强度与荧光物质的浓度成正比 不过这种线性关 系只在稀溶液中才成立 二 荧光仪器 第一单色器 或滤光片 记录仪 第二单色器 或滤光片 荧光 光源 激发 样品池 1 光源 要求具有强度大 适用波长范围宽等特点 常用的有 高压汞灯和氙灯 前者使用的谱线365nm 405nm 436nm 后 者是连续光源 可用于200 700nm波长范围 此范围内光强几乎 相同 此外还有激光 3 两个单色器 选择激发光

14、单色器 分离荧光单色器 前者 用于选择所需要的激发光的波长 后者消除溶液中可能存在 的其它光线的干扰 以获得所需要的荧光 4 检测器 光电倍增管 2 样品池 石英 低荧光材料 荧光分析的特点 灵敏度高 视不同物质 检测下限在0 1 0 001 g mL之间 可 见 比UV Vis的灵敏度高得多 选择性好 可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性 结构信息量多 包括物质激发光谱 发射光谱 光强 荧 光量 子效率 荧光寿命等 应用不广泛 主要是因为能发荧光的物质不具普遍性 增 强荧光的方法有限 外界环境对荧光量子效率影响大 干扰 测量的因素较多 三 磷光分析 1 磷光的特点 磷光波长比荧光的长 T1 S

15、1 磷光寿命比荧光的长 磷光为禁阻跃迁产生 速率常数小 磷光寿命和强度对 重原子和氧敏感 自旋轨道耦合 使去活化速率常数增加 2 低温磷光 液氮 由于磷光寿命长 T1的非辐射跃迁 内转换 几率增加 碰 撞失活 振动弛豫 的几率 光化学反应几率都增加 从而降低 磷光强度 因此有必要在低温下测量磷光 同时要求溶剂 易提纯且在分析波长区无强吸收和发射 低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体 常用的溶剂 EPA 乙醇 异戊烷 二乙醚 2 2 5 IEPA CH3I EPA 1 10 3 室温磷光 低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制 1974 年后发展了室温磷光 RTP 1 固体基质 在室温下

16、以固体基质 如纤维素等 为吸附磷 光体 增加分子刚性 减少三重态猝灭等非辐射跃迁 从而 提高磷光量子效率 2 胶束增稳 利用表面活性剂在临界浓度形成具有多相性的 胶束 改变磷光体的微环境 增加定向约束力 从而减小内 转换和碰撞等去活化的几率 提高三重态的稳定性 利用胶束增稳 重原子效应和溶液除氧是该法的三要素 3 敏化磷光 其过程可以简单表示为 4 磷光仪器 在荧光仪样 品池上增加磷光 配件 低温杜瓦 瓶和斩光片 如 右图所示 斩光片的作 用是利用其分子 受激所产生的荧 光与磷光的寿命 不同获取磷光辐 射 转筒式转盘式 6 2 化学发光分析 一 概述 1 化学发光 利用化学反应所释放的化学能激发了体系中某种 化学物质分子 当受激分子跃迁回到基态时而产生的光发射 2 化学发光分析法 利用化学发光测定体系中化学物质浓 度的方法 直接化学发光 A B C D C C h 被测物A的产物被激发发光 间接化学发光 A B C D C F F E F F h 待测物的产物作为激发中间体将能量传给受体F F 发光 3 特点 1 灵敏度极高 例如 用荧光素酶和三磷酸腺苷 ATP 的化学 反应可测定低至