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1、蛋白质考试总结范文 第一章功能基因组与蛋白质组蛋白质组学研究的意义蛋白质组学产生的背景蛋白质组学基因组的局限性，全方位蛋白质研究的迫切要求，医药研究开发的巨大需求（药靶、加速研发速度），高通量分离、鉴定技术的出现，计算机信息科学的有力支持蛋白质组的基本知识蛋白质组(proteome)由Marc Wilkins在1994年提出，由protein与genome复合而成。 一种基因组所能表达的全套蛋白质；一完整生物的全套蛋白质；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合。 一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱蛋白质组学的几个主要研究方向针对已有基因组或转录组数
2、据库的物种或组织/细胞，建立蛋白质组或亚蛋白质组（蛋白表达谱）及蛋白质组连锁群positional proteomics（完全蛋白质组学检测一种细胞类型或一种组织内基因组表达的所有蛋白质）以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要的生理/病理体系或过程的比较蛋白质组研究parative proteomics（差异蛋白质组学主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的区别与变化）蛋白质组学的技术平台（双向电泳的分辨率、上样量、蛋白鉴定手段、蛋白质之间相互关系作用联系）和蛋白质组信息学的进一步发展。 第二章蛋白质组研究方法蛋白质组的技术基础（三大支撑技术）双向电泳(2-DE)（使数以千计
3、的蛋白得到有效的分离）；生物质谱技术（精确测定生物大分子相对质量及多肽序列）；计算机为基础的图像分析及相应数据库构建除上述基本研究技术外，其它技术用于大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱与质谱联用技术。 定量蛋白质组学中应用的同位素编码亲和序列标签技术(ICAT)和双色荧光技术。 用于蛋白质间相互作用研究的酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid system)和蛋白质复合物(protein plex)免疫分离技术（免疫共沉淀，coimmunoprecipitation,CoIP）2-DE的局限性样本的要求质谱鉴定2-DE分离的蛋白质，主要的一个功能是寻找新的蛋白，但是并不能确定蛋白的组织
4、特异性，所以要求被检测组织是单纯的，所以要特别注意样本的均一性。 激光捕获显微切割(laser-capture micro-dissection,LCM)重复性需要有经验的人员进行操作，并要花费相当多的时间、精力对条件进行优化。 除电泳条件外，样品的获得和处理也非常重要，特别是进行比较蛋白质组研究时动态范围（检出限和负载量的问题）基于mRNA的研究方法动态范围为个数量级，细胞中蛋白质的动态范围达个数量级。 同位素标记蛋白质可极大提高蛋白质的检出限，但后续的质谱灵敏度难以满足要求。 过多的上样量会降低电泳分辨率蛋白质丢失疏水性蛋白和分子量大于100KD的蛋白容易丢失通量和自动化蛋白由胶上回收，到
5、质谱分析上样是体系的瓶颈，2-DE胶上蛋白的识别与鉴定已基本自动化，但作为蛋白识别基础的图像分析仍费时较多，是整个体系的瓶颈2色谱质谱技术目的是弥补以2-DE/MS为基础的蛋白质组技术方法的不足:疏水性蛋白和分子量大于100KD的蛋白容易丢失、蛋白的胶上回收和图像分析影响高通量和自动化、重复性差、检测范围相对较窄主要特点快速（1-2小时）；易于和质谱连用（液相系统，避免胶上回收）；适用于各种蛋白质的分离（疏水性、酸碱性、大小）二维色谱有多种组合模式第一维离子交换色谱；凝胶过滤色谱第二维反相色谱 3、同位素亲和标记质谱技术细胞中蛋白质数目巨大，酶切后的多肽混合物十分复杂，现有的2-DE和2D-H
6、PLC都难以完全分离。 1999年Gygi等人利用稳定同位素稀释原理发明同位素亲和标签技术（Isotope CodedAffinity Tags，ICAT）使样品成分简化，并且能够定量检测蛋白ICAT试剂由三部分组成活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；连接子，用于结合稳定的同位素；生物素(Biotin)，作为亲和标签，可以和卵白素结合，用于选择分离标记的多肽。 ICAT方法的关键是的应用。 ICAT试剂由三部分组成首先，对蛋白质进行标记，蛋白酶切形成多肽混合物；亲和色谱分离只有标记肽段被保留（先洗脱下未标记肽段，再洗脱下别标记肽段）；比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度，可
7、以实现对差异蛋白质的定量分析；采用串联质谱技术测定肽段序列，可以实现蛋白质鉴定。 第三章双向电泳的蛋白质提取与样品制备选择制备方法的原则一定要明确研究目的是获得尽可能多的蛋白，还是仅获得感兴趣的某些蛋白？全蛋白表达谱？可重复的清晰的图谱？影响制备效果的因素提取方法视具体要求而定样品的、类型差异；蛋白质丰度变化范围较大；亲、疏水性；酸碱性蛋白质的分步提取技术利用蛋白质溶解性的不同进行分步提取，采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取液，但仍然难以提取到样品的全部蛋白。 此外，疏水的膜蛋白等以及高度抗性组织（头发、皮肤等）的蛋白亦难以进行2-DE。 硫脲、sulfobetaine和TBP可极大提
8、高样品的溶解度，联合运用硫脲、表面活性剂SB3-10和TBP，可构成高效IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白，但也有一定缺陷对于复杂样品而言，2-DE分离会出现很多重叠的蛋白点1998年，Molloy把分步提取法和高效裂解缓冲液联合起来，得到高分辨率的2-DE图谱具体步骤第一步以水溶液提取:5-15mg细胞以2ml裂解液I(40mmol/L Tris)重悬，反复冻融3-4个循环，加入适量DNase I和RNase A消化核酸，离心收集上清，冷冻干燥（只溶解偏亲水性蛋白）第二步以含Urea/CHAPS/DTT的溶液提取向第一步的沉淀中加入500?l裂解液II(8mol/L Urea,4%CH
9、APS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%Pharmalyte3-10,20?g/ml DNaseI和5?g/ml RNaseA)，振荡混匀，离心收集上清（传统裂解、溶解亲水性、中性和疏水、性蛋白）第三步以含硫脲/SB3-10/TBP的溶液提取第二步的沉淀以40mmol/L Tris洗涤，加入200?l裂解液III(5mol/L Urea,2mmol/L thiourea,2%CHAPS，40mmol/L Tris,0.5%Pharmalyte3-10,2%SB3-10,2mmol/L TBP,20?g/ml DNaseI和5?g/ml RNaseA)，振荡混匀，
10、离心收集上清，保存于-70（主要溶解、疏水性蛋白）用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制:蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。 如有可能，可加入强变性剂8mol/L尿素、10%TCA、2%SDS但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。 由于蛋白酶抑制剂的专一性，需要多种抑制剂混合使用蛋白酶抑制剂鸡尾酒(protease inhibitorcocktail)1)PMSF（苯甲基磺酰氟）2)AEBSF（PefablocTM SC）3)EDTA、EGTA4)肽蛋白酶抑制剂亮抑酶肽(leupeptin)，抑制某些丝氨酸蛋白酶和半胱
11、氨酸蛋白酶活性；胃蛋白酶抑制剂A(pepstatin A)，抑制天冬氨酸蛋白酶（如酸性蛋白酶）活性；抑蛋白酶肽(aprotinin)，抑制许多丝氨酸蛋白酶活性；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶活性；均为小肽，可能会出现在2-DE图谱中5)TLCK（甲苯磺酰赖氨氯甲酮）6)Benzamidine通过沉淀分离蛋白分离策略沉淀蛋白质，使之与其他成份分开，再重悬溶解蛋白质附带作用浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）注意某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失沉淀方法1.硫酸铵沉淀（盐析）2.TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）3.丙酮沉淀4.在冰丙酮中用TCA沉淀第四章双向电泳与蛋白质分离原理:利用了蛋白的两
12、个特性对其进行分离第一向，等点聚焦电泳利用蛋白的等点电进行分离；第二向，SDSPAGE利用蛋白的相对分子量分离理论上，如果第一向能把样品按PI分离100亚组，第二向按MW把每个亚组分成100蛋白点，则能够分离10000种蛋白质等点聚焦电泳构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质的在一定的pH条件下带有电荷。 蛋白质所带的净电荷构成蛋白质的所有氨基酸残基所带正负电荷总和在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负；在某一pH条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此pH为该蛋白的等电点(pI)蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质的一个物理化学常数，可以据此特性
13、分离蛋白质据此，设计含有pH梯度的凝胶。 在外加电场作用下，蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处immobilines可按任意比例调配，制成各种pH范围的胶条IPG胶条使用胶条机械性能好、重现性好、易处理、上样量大以及能够避免电渗漏从而确保pH值稳定IPG胶条的平衡;在第二向电泳分离前，必须对胶条进行平衡第一步15min平衡液成分50mmol/L Tris-cl(pH8.8)，2%SDS，20mmol/L DTT，6mol/L尿素和30%甘油平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高于1mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4g SDS)，掩盖蛋白所带电荷，并使构
14、象均呈雪茄装，这样，第二相电泳时，迁移率就会主要取决于蛋白的相对分子质量尿素和还原剂的作用是除去蛋白高级结构，使之与SDS充分结合，尿素和甘油可以减缓电渗效应，防止一向到二向转移率降低第二步15min平衡液成分50mmol/L Tris-cl(pH8.8)，2%SDS，100mmol碘乙酰胺代替20mmol/L DTT，6mol/L尿素和30%甘油。 为的是除去DTT，否则DTT会在第二向电泳中泳动，影响分离效果还有一步平衡法用5mmol/L TBP代替DTT(TBP不带电荷不在SDS-PAGE中迁移)2SDSPAGE一向胶转二向胶必须注意一避免二者的接触面之间产生气泡，否则影响2-DE重复性
15、；0.5%琼脂糖封胶，固定IPG胶条各种蛋白具有相同的荷质比，迁移速率主要取决于相对分子量3胶上蛋白检测 一、考马斯亮蓝染色特点简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼容缺点检出限10ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h） 二、银染特点灵敏度200pg缺点醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定，但可比性差 三、负染 四、荧光染色第五章图像分析与细胞蛋白谱的建立1蛋白质图像分析系统完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存，以数字化图像的形式储存起来图像采集系统必须具有透射扫描功能灵敏度高；吸光值蛋白质点的光密度表达丰度2-DE图像分析1蛋白质
16、点检测(spot detection)位置、形状、丰度（体积）和面积围绕每个像素点构建一个算子(operator)，比较算子中心和边缘的光密度值，比值达到一定强度即确认为是蛋白质点的一部分2背景消减(background substraction)凝胶不可避免的要被染色，其光密度会被采集系统认为是蛋白质点，所以扣除背景染色对蛋白丰度计算的影响，边界最低强度消减、边界平均强度消减等方法3归一化处理(normolization)不同处理的样品，平行进行双向电泳后，不同的胶上的同一种蛋白质会由于实验过程存在的误差，形成系统误差，在进行相互比较之前，必须进行归一化处理，才可以确保是相同数量的实验材料进行对比。 基于所有点或某一点（已知
