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1、 第八章.免疫组化双重染色技术(Doublestainingtechnologyinimmunohistochemistry)用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两种以上的抗原,以发现其定位,形态和功能上的相互关系.一.连续切片双重染色法A.最简单最可靠.用同样的免疫组化方法,在两张相邻切片上各显示一种抗原,然后比较.由于每张切片上只进行一次染色,所以不会互相干扰或出现假性双标记.B.切片厚度13Hm.如果较厚如神经组织切片(1020hm)可以采用“镜像“法,即相邻切片翻转后贴在载玻片上,或利用软件PS.二.免疫荧光双重染色法:用不同的荧光色素标记不同的抗体,染色后观察,相应的抗原物
2、质显示不同的颜色.A.直接法:1.一步法:将FITC(490495_,520530nm,黄绿色荧光)和TRITC(550一620nm,红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混合,使每个抗体均为最适稀释度,然后孵育切片.2.二步法:先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.TRITCFITC观察:同一个视野里.对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相,每张照片显示一种荧光比较两张照片.两种荧光重蔡照相,则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色)如果两种抗原存在于同一个细胞或结构,则呈现两种红绿荧光的混合色,如黄色.p58/Golgi|bPresenilin1r/免
3、疫荧光双重染色法:FITC绿色,TRITC红色,混合色为黄色B.间接法:1.两种一抗不标记,但来自不同种属的动物如免和豚鼠.2.两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠lgG,或羊抗兔lgG和猪抗豚鼠lgG)分别以FM3.染色程序:TC和TRITC标记.a先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片,显示第一种抗原;然后再用第二种一切片,显示第二种抗原.汪和相应的标记二抗依次孵育b.将两种一抗混合后孵育切片,再将两种标记的二抗混合后孵育切片,最后用荧光显微镜观察.免疫荧光双重染色法:FITC绿色,TRITC红色,混合色为黄色AntMycAnti-USP26-W12YWLin
4、.USP26stainedbyAlexaFluor488andMycstainedbyAlexaFluor594inCOS7cells.NucleiwerestainedbyHoechstblue三.免疫酶双重染色A.单酶法:1.原理:a用一种酶如HRP标记显示两种不同的抗原,但用不同的电子供体如DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物b.两种一抗来自同种属动物,两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体,酶和反应产物从组织上洗脱.c.连续做两次染色,所费时间较长.二=廖沅胜各级抗体亡二L技式燮pholographypholography一一佳、-A_D心口-一_A口-_=口-12抗
5、体,酶和反应产物洗脚2.染色的最佳条件:先对两种待检抗原分别染色,以决定合适的抗体稀释度和反应条件等3.双重染色的先后次序:a先显示含量较少的抗原.b.先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原.c.先用不太敏感的抗体d先用DAB显色.4对照试验:a.单染对照.b.在进行第二次染色前,要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去,而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.88Gaa60敷鲜茹交盅豚B66E5.抗体洗脱:a.酸洗法:pH2.2甘氨酸-HCI缨冲液(可加入适量二甲基甲酰胺DMF)14小时使抗原-抗体复合物解离.b.氧化法:2.5%KMnOi:5%HoSOx:DDHzO=1:4:10260,1分,氧化除去抗体,0.5%NazS,0;漂白液脱色.第一次染色用CN显色,并注意对第二种抗原的影响.c.甲醛蒸气法:1升容器+3g多聚甲醛+切片,置80C烤箱14小时,燃汽破坏抗体的lg结合部位第一次用ABC法,氧化法洗脱抗体-对照试验证实此为假性双标-
