《植物分子生物学实验技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物分子生物学实验技术（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物分子生物学实验技术班 级：研122班专 业：作物生物技术姓 名：陕建国学 号：20122419授课教师：李红英老师实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论一、提取植物DNA和RNA的用处提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。（一）提取植物DNA的用处DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交
2、、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法提取植物DNA的试验原理：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液
3、中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。（一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验试剂：1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH
4、调至pH7.0，并定容至1000ml。2、10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4、0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6 氯仿异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8、SDS（十二烷基硫酸
5、钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1molL HCl。10、0.2mol/L NaOH。11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液浓乙醛：H2O1：50（VV）。12. 1.0mol/L 高酸溶液（HClO4）。13、高氯酸溶液。14、0.05mol/L NaOH。15、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/L NaOH定容至25m
6、l，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml 1mol/L HClO4，混合冷却后用0.5mol/L HClO4定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。实验步骤 ：1、 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2、 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3、 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4、 将试管置72水浴中保温3min（不超
7、过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L 高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1（VV），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5、 再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6、 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7、 然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8、 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9、 加入已处理的Rnase
8、溶液，使其最后的作用浓度为5070g/ml，并在37水浴中保温30min，以除去RNA。10、 加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11、 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。（二）植物DNA的CTAB提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验步骤：1、 称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。2、 将粉末转移到加有7ml经预热的15CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65水浴中，温育30min。3、 取出离心管,冷却至室温，加入氯
9、仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。4、 将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。5、 转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。6、 加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5l RNase置于56水浴中过夜。7、 待DNA完全溶解后，加2-3ml 4预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。8、 离心机
10、甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。9、 将风干的DNA直接在4保存备用或溶于100l TE溶液中于-20保存. （三）植物叶片的提取步骤（来自http:/ eppendorf 管中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。7、如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。9、加入5lRNaseA（
11、10g/l）,37 10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10、加入1/10体积的3mol/L NaAc 及2体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。11、用玻璃捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。12、将DNA重新溶解于1 ml TE中，20贮存。三、植物RNA的提取植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA
12、。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占15。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3末端都具有20200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。 植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不
13、需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。 内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。 外源
14、RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.050.1DEPC，37处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22m 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。 提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙
