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1、cDNA末端快速扩增技术 rapidamplificationofcDNAends RACE 1 技术背景基本RACE原理和方法样品要求RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得 基本RACE原理 2 技术背景 得到某基因的片段 全长或近全长cDNA的方法 建立和筛选cDNA和DNA文库 利用GenBank数据库中的表达序列标签 expresssequencetags ESTs 拼接出全长或近全长cDNA 是多聚酶链式反应即PCR cDNA末端快速扩增 RACE 技术 3 基本RACE原理和方法 利用Oligo dT 对mRNA进行反转录的同时在两头加上通用接头 引物 从而可利用基因特异的引物 g
2、enespecificprimer GSP 通过PCR反应快速获得目的序列的5 端和3 端 4 RACE流程 5 5 RACE法原理图 1 2 3 4 RNaseH 6 样品要求 提取TotalRNA的材料要新鲜 采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂 TotalRNA无降解 OD260 280 1 8 2 0 提供尽量多的实验材料 3 RACETotalRNA 15 g 5 RACETotalRNA 25 g 如果基因的含量较低或者未知序列较长 样品量需相应增加 7 RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得 3 或5 双链cDNA 限制性内切酶酶切 Southernblot分析 克隆 3 和
3、5 重叠序列的连接 RACE产物的3 和5 末端序列的分析 合成相应引物 PCR获得全长cDNA 8 SMARTRACEcDNAsynthesisKit 9 SMARTRACEcDNAsynthesisKit 碱基互补配对原则 AT之间形成两个氢键GC之间形成三个氢键 poly C 替代poly A 增加5 接头与cDNA第一链的结合牢固性 增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率 10 SMARTRACEcDNAsynthesisKit原理 11 cDNA第一链的合成机制 12 SMARTerRACE流程 13 5 RACE流程图 14 3 RACE流程图 15 GSP与cDNA模板的关
4、系 GSP要求 23 28nt50 70 GCTm 65 降落式 touchdown PCR Tm 70 与通用引物的3 末端不互补 16 GSP与cDNA模板的关系 GSP1 5 RACEPCR的反义引物GSP2 3 RACEPCR的正义引物 合适的酶切位点 100 200bp 注意 GSP1与GSP2的Tm值要相似 17 GSP与cDNA模板的关系 NGSP 槽式 Nested PCR引物 18 扩增后的预期 19 具体实验方法 cDNA第一链的合成阳性对照RACEPCR实验cDNA末端的快速扩增RACE产物鉴定试剂盒试剂 20 比较用GSPs和NGSPs引物获得的PCR产物SouthernblotanalysisNucleoTrapGelExraction克隆和测序RACE产物 21
