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1、八 常规组织培养法 消化培养法组织块培养法 1 1 消化培养法 用品 取自人或动物体的新鲜组织1 5cm3Hanks液100ml胰蛋白酶 O 025 50 100ml培养液 含血清10 20 50ml吸管 直头 和胶帽各10个平皿 直径6厘米 4套培养瓶若干 2 烧杯 50m1 2个电磁搅拌器1个三角烧瓶 100m1 1个不锈钢筛 20 m 100 m 200 m 各1个眼科剪2把眼科镊2个计数板1块 3 步骤 1 准备 取各种已消毒的培养用品置于净化台面 紫外线消毒20分钟 注意 组织块 胰蛋白酶 培养液等易受紫外线伤害的物品 最好在培养时再携入操作野 如预先置入 需用纸张覆盖 以免受射线影
2、响 开始工作前先洗手 75 酒精擦拭手至肘部 2 布局 点燃酒精灯 或煤气灯 安装吸管帽 应通过火焰 4 3 处理组织 把组织块置入烧杯中 用Hanks液漂洗2 3次 去除血污 如怀疑组织可能污染 可先置于含有青链霉素的混合液中30 60分钟 4 剪切 用眼科剪把组织块切成2 3毫米大小的块 用手术刀切割亦可 以便于消化 加入比组织块总量多30 50倍的胰蛋白酶液 然后一并倒入三角烧瓶中 结扎瓶口或塞以胶塞 5 5 消化 或用恒温水浴 或置 37 C温箱消化均可 消化中每隔20分钟应摇动一次 如用电磁恒温搅拌器消化更好 消化前瓶中需置一无菌搅棒 消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定 6 6
3、分离 在消化过程中见消化液发混浊时 可用吸管吸出少许消化液在镜下观察 如组织已分散成细胞团或单个细胞 立即终止消化 随即通过适宜不锈钢筛 滤掉尚未充分消化开的组织块 必要时可继续进行消化 低速 500 1000转 分 离心消化液5分钟 吸出上清 加入适量含有血清的培养液 如用其它酶或EDTA等消化 需用Hanks液洗脱一两次后 再加入培养液 7 7 计数 用计数板计数 如细胞悬液细胞密度过大 再补加培养液调整后 分装入培养瓶中 对大多数细胞来说 pH要求在7 2 7 4范围 培养液呈微红色 如颜色偏黄 说明液体变酸 可用NaHCO3调整 8 8 培养 置入37 C温箱培养 如用CO2温箱培养
4、瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽 松口 堵塞 纱布塞易生霉菌 每次换液时需更换新塞 评价 胰蛋白酶消化培养法 能把组织块分散成细胞团或单个细胞 便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物 细胞能较快地长成单层 本法尤适用于培养大量组织 细胞产量高 但用于经常性小量培养工作稍显繁琐 无菌操作不良时且易污染 9 10 组织块培养法 用品 取自人或动物体的新鲜组织1 5cm3Hanks液100mlNaHC032ml胰蛋白酶 O 025 50 100ml培养液 含血清10 20 50ml吸管 弯头和直头 和胶帽各10个培养瓶若干烧杯 20m1 或青霉素小瓶各1个眼科剪2把眼科镊2把 11 程序 1 剪切 把组织
5、小块 1cm3 置入小烧杯或青霉素小瓶中 用Hanks液漂洗2 3次以去掉表面血污 吸净Hanks液 用眼科剪反复剪切成lmm3块为止 2 摆布 用弯头吸管吸取若干小块 置入培养瓶中 用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上 小块相互距离为0 5cm为宜 每一25ml培养瓶底可摆布20 30块 12 3 轻轻翻转培养瓶 令瓶底向上 注意翻瓶时勿令组织小块流动 塞好瓶塞 置37 温箱2小时左右 勿超过4小时 使小块微干涸 13 4 培养 从温箱中取出培养瓶 开塞 46度斜持培养瓶 瓶底仍向上 向瓶底角部轻轻注入培养液少许 然后缓缓再把培养瓶翻转过来 让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块 组织小块附着
6、尚不牢 注意不要把组织块冲走 置温箱中静止培养 待细胞从组织块游出数量增多后 再补加培养液 14 评价 翻转培养瓶的目的是为使组织块微干涸 以利贴附和免从瓶壁流失 但时间不宜过长 超过三四小时以上可能对组织有不利影响 组织块培养法操作简便 顺利情况下 组织小块贴壁培养后24小时 细胞即可从小块边缘向四周游出 通过生长增殖 最终亦可连接成片 原组织小块可完全散成细胞而消失 15 如组织块过大 残留小块换液时弃掉或再置另瓶中继续培养 组织块通过反复剪切可能受一定损伤 并非每块组织都有生长能力 但只要有一部分能生长往往即可形成单层 16 17 3 初代培养意义的讨论 组织初代培养是后续培养的关键阶段
7、 初代培养成功与组织污染与否 供体年龄 培养操作技术和方法 适宜培养基的选择等多种因素有关初代培养是各种培养必经阶段 总的看 对某一组织进行初代培养时 在未掌握规律和找到适宜培养条件之前 一是比较困难的 一旦成功和能进行传代培养成为细胞系后 细胞则较易生存 但传代后的细胞也并非总是一帆风顺 有时生长一段时间 未达终极期便衰退死亡 说明培养环境仍不理想 初代培养细胞刚离开机体 生物学性状与生物学性状与原体内细胞比较接近 适用于做药物检测等实验 18 九 特殊培养法 一 二倍体细胞培养法 DiploidCellCulture 所谓二倍体细胞培养 是培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法 因其
8、与体内细胞相似性大 在实验中有很大应用价值 二倍体细胞来源体内二倍体细胞 也即正常细胞的初代培养 初代培养细胞成功后能始终保持二倍体细胞性状 便成为二倍体细胞培养 19 要点二倍体细胞虽不难培养 但欲求长期呈旺盛地增殖生长 并保持二倍体细胞性状 亦非易事 为此必须采取一些有效的措施 一是低温冻存 二是妥善的培养方法 用反复传代的方法以求获得大量细胞和维持细胞长期生存的办法是不妥的 因为在反复传代中 难免由于培养条件的变化和其它不利影响 使细胞生物学性状发生变化 随时间延长不仅能导致细胞停止生长 并可失掉二倍体性状或发生转化 20 采取以下措施可能利于二倍体细胞培养 严格控制pH值 最好在5 C
9、O2温箱中培养 换液时间不要间隔太长 且不要全部更新 尽量保留一部分旧培养液 以弃掉1 2或2 3为妥 传代期不能过长 不能让细胞长得过于密集 一旦细胞接近或刚刚连接成片 即进行传代 21 要选用高质量的培养基和血清 并尽量维持不变 每次传代都按一分为二的原则 细胞数量 营养液量 培养瓶的空间和面积都一样 进行培养 传代后如细胞不用于实验 立即低温冻存来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂50次左右即进入衰退期 22 不同种类和来源的二倍体细胞生存期都不一样 但生存期皆有限 虽然二倍体细胞具有限的生存期 却完全能满足反复使用的要求 而在实际应用上 初代接种的细胞都几十万以上 因此一个二倍体细胞系
10、最终提供的细胞数量近于无限的 23 方法二倍体细胞培养方法与一般培养相同 关键在于传代 其传代程序为 1 吸除旧培养液注入另瓶中 2 用温BSS冲洗1次 3 用O 25 温胰蛋白酶消化 加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可 作用1 5分钟 24 4 待细胞附着松动 细胞质边缘卷起和间隔加大 便终止消化 为防止细胞丢失 可不必再用BSS冲洗 直接向瓶中加入培养液 新旧培养液按2 1新旧混合 5 轻轻反复吹打制成单个细胞悬液 消化不足或吹打不充分 易形成细胞团 不利于生长 应注意避免 6 按一分为二比例接种培养 25 讨论 如何能保留有大量可利用的二倍体细胞 首先在初代二倍体细胞培养时 要接种多量细胞
11、 生长成功后立即冻存做为种细胞 Stock 用于实验时 解冻1分Stock 传1 3代 二倍体细胞是可长期应用的 26 27 注意 传代是细胞培养中经常性操作 有三点注意事项 把握好传代时机 已如前述 在80 90 汇合阶段最好 过早传代细胞产量少 过晚细胞健康状态不佳 二是消化时间要适度 过短细胞不易从瓶壁脱落 过长细胞可脱落流失 28 三是消化液浓度要适宜 过浓时消化作用强烈 细胞反应快 所需消化时间短 掌握不好 细胞易流失 另外各种细胞对消化反应不同 有的敏感 有的迟钝 因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施 有的细胞附着瓶壁不牢 用吸管可从瓶壁直接吹下来 但这样容易伤害细胞 细胞大片脱
12、落掉 不易计数 应尽可能采用消化法分散细胞为妥 29 消化传代良好时 细胞受损害少 细胞悬液均匀 各分装样品中数量误差小 细胞生长增殖速度一致 实验结果可靠性大 30 二 加支持物培养法 加支持物培养法是预先向培养容器中加入各种可使细胞贴附的支持物 进行培养的方法 待细胞贴附于支持物生长增殖后 可进行各种实验和观察 观察时可把支持物从瓶中抽出 能做各种技术处理 是研究工作中常用的方法之一 各种对细胞无毒性的如玻璃 塑料 鸡卵壳膜 胶原 硅橡胶 袋泡茶包装纸等 均可做支持物用 31 1 支持物制备特制有机玻璃 特氟隆薄膜 玻璃等 其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用 前者便于做各种固定 染色处理和观
13、察 后者最适做电镜技术 允许做包埋和切片 32 加支持物培养法程序与一般培养法相同 只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物 特氟隆薄膜为定型无菌包装产品 用时无菌条件下启封 用剪刀按需要剪成各种不同大小的块 于培养接种细胞前 先置入培养容器中即可 通常多用盖玻片做支持物 用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态 以便装入培养瓶中 然后按如下顺序处理 自来水浸泡24小时 96 酒精30 60分钟 蒸馏水浸泡30 60分钟 用干净软布擦拭干净 擦时应戴白手套工作 装入培养器皿中 高压或干热灭菌备用 33 2 培养法 初代消化培养 初代组织块培养 传代培养等皆可应用加支持物培养法 接种细胞后 可在任
14、何时间取出支持物 做各种观察或实验 支持物培养法中最重要的是支持物一定要处理干净 不残留任何对细胞有害成分 以免不利细胞贴附和生长增殖 34 三 单细胞分离 克隆 培养 单细胞分离培养又称细胞克隆 Cellcloning 即把单个细胞从群体内分离出来单独培养 使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术 初代培养细胞或其它未经细胞克隆化的细胞系都具有异质性 细胞经过克隆以后 后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞 即形成所谓纯系 称细胞株 CellStrain 细胞株的细胞遗传性状差异减少 生物性质均一 利于实验研究 35 1 原理 从理论上说各种培养细胞都可用以进行克隆培养 但实际上 初代培养细胞和有
15、限细胞系 二倍体细胞 比较困难 无限细胞系 转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易 其原因是 当体内任何细胞被置于体外培养后 对培养环境都有一个适应过程 期间细胞对营养液具有同化作用 即从培养液中摄取营养的同时 也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质 其中有排泄物 也有促细胞生长物质 36 有人称之为化学信使 具有促克隆细胞生长作用 实则为生长因子类物质 单细胞同化营养液能力不如群体细胞强 初代培养细胞 有限细胞系不如无限细胞系 转化细胞和肿瘤细胞强 转化细胞和肿瘤细胞强的原因 可能与它们有自泌 Autocrine 和内泌 Endocrine 即自己合成生长因子能力有关 37 凡对培养环境有较大
16、适应性和具有较强独立生存能力的细胞 均易做细胞克隆 克隆细胞时 要把细胞先制备成单细胞悬液 再接种培养在底物上 让细胞单独生长 适应性较大和活力好的细胞能增殖形成细胞小群 Colony 克隆 细胞群单个细胞形成克隆的百分数称克隆形成率或克隆率 CloningEfficiency 也称接种率 SeedingEfficiency 两词都可用于表示细胞生活力和独立生长能力 但克隆形成率含义比接种率更为确切 38 2 提高克隆形成率的措施细胞经过稀释后 在低密度状态下培养时 克隆形成率明显下降 即克隆形成率与细胞的密度成正比 对无限细胞系克隆形成率一般很少降到10 以下 但初代培养细胞和有限细胞系的克隆形成率则很低 仅有0 5 5 甚至为零 因此必须提高细胞克隆形成率才易克隆成功 为此常采取以下一些措施 培养基 为提高细胞克隆形成率 选择适当的培养基是非常重要的环节 现知以下一些培养基用作克隆时效果可能较好 39 常用细胞克隆培养基 40 以上培养基都是个别研究者选用的 难免有一定的局限性 事实上分散于各实验室的同一种细胞 经过长期培养后 难免发生一些适应性变化 因此同一种培养基也不一定能适用
