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1、细胞培养基本技术和注意事项 1 细胞培养概念 2 细胞培养目的和作用 基础研究 1 药物作用机理2 基因功能3 疾病发生机理 生物制药 1 疫苗生产 2 基因工程药物生产 3 细胞工程药物生产 3 细胞培养相关条件 一般细胞培养实验室1 独立空间 相对无菌操作的实验室2 生物安全柜 超净工作台 生物安全柜是为操作原代培养物 菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时 用来保护操作者本人 实验室环境以及实验材料 使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的 4 生物安全柜 超净工作台 二氧化碳培养箱 5 细胞培养相关条件 3 相关仪器设备 1 CO2培养箱 2 倒置显微镜
2、 普通显微镜及照相系统 3 冰箱 4度 20度 4 离心机 水浴锅 5 细胞存储器 液氮罐 80度冰箱 6 高温高压灭菌装置 清洗装置 7 滤菌相关仪器 针式滤器 泵加压过滤 8 天平 pH仪等 6 细胞培养相关条件 培养用品 培养瓶 25 75cm3 培养板 96 48 24 12 6孔 培养皿 各种直径规格 7 细胞培养相关条件 培养用品 离心管 15 50ml 移液管 吸管冻存管 EP管试剂瓶等 8 细胞培养相关条件 细胞培养用试剂 培养基 a MEM DMEM DMEM F12 RPMI1640 血清 胎牛血清 新生牛血清 小牛血清 抗生素 青 链霉素双抗 添加因子 生长因子 EGF
3、bFGF BFGF 胰岛素 肝素 二巯基乙醇等 消化酶 胰蛋白酶 胶原酶 分散酶等 9 培养细胞技术 基本操作 1 无菌操作 防止微生物污染 培养用一切物品 液体都无菌 2 操作区消毒 75 酒精擦拭 生物安全柜 进入操作区物品 紫外消毒20 30min 3 实验操作 动作稳 准 幅度小 物品摆放合理 工作有序 缩短暴露时间 10 培养细胞技术 细胞来源 一 原代培养 从机体上取下细胞 组织或器官 让它们在体外维持与生长 实际中 传10代以内的细胞用作原代培养细胞 特点 表现来源组织或细胞特征 1 组织块培养法 从机体上取下组织 使其在体外维持与生长 细胞从组织块边缘向外长出 铺满培养瓶 皿
4、即可进行传代 11 培养细胞技术 2 消化培养法 与组织块培养法区别 A 用酶制剂处理组织块 除去细胞间质 使细胞分离 形成细胞悬液 B 细胞生长方式多为单层 优点 更易摄取营养 排除代谢产物生长较快 缺点 操作繁杂 易污染 消化可能对细胞有损伤 bMSCP0 bMSCP5 bMSCP14 12 二 细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 称细胞株 通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株 培养细胞技术 MDA MB 231 MCF 7 iPScell 13 培养细胞技术 培养细胞的生长方式 贴附生长 必须贴附于支持物表面才能生长 其
5、依靠自身分泌的或培养基中提供的粘附因子才能在该表面生长和繁殖 大多数哺乳类细胞细胞属此型 成纤维细胞样或上皮细胞样 悬浮生长 于悬浮状态下即可生长 不需要贴附于支持物表面 见于各种造血系统肿瘤细胞 14 培养细胞技术 细胞培养常规操作技术 1 细胞传代 细胞在培养瓶长成致密单层后 已基本上饱和 为使细胞能继续生长 同时也将细胞数量扩大 就必须进行传代 再培养 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法 同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程 悬浮型细胞直接分瓶就可以 而贴壁细胞需经消化后才能分瓶 15 根据细胞生长的特点 传代方法有3种 悬浮生长细胞传代离心法传代 离心 1000转 分 去上清
6、 沉淀物加新培养液后再混匀传代 半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象 但贴壁不牢 可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来 进行传代 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代 常用的消化液有0 25 的胰蛋白酶液 培养细胞技术 细胞传代方法 16 培养细胞技术 贴壁细胞传代操作流程 1 弃去培养液 2 加入胰酶溶液 使瓶底细胞都浸入溶液中 3 消化时间约为1 3分钟 倒置镜下观察细胞 原贴壁的细胞逐渐趋于圆形 细胞间出现空隙 细胞未漂起时弃去胰酶 同时用Hanks或培养液终止消化 4 制作细胞悬液 细胞计数 有经验者可省 根据细胞数目和细胞生长特点 按1 2 1 6进行传代 置37 下继续培养 1
7、7 培养细胞技术 2 细胞冻存 在不加任何条件下直接冻存细胞时 细胞内和外环境中的水都会形成冰晶 能导致细胞内发生机械损伤 电解质升高 渗透压改变 脱水 PH改变 蛋白变性等 能引起细胞死亡 如向培养液加入保护剂 可使冰点降低 在缓慢的冻结条件下 能使细胞内水份在冻结前透出细胞 贮存在 130 以下的低温中能减少冰晶的形成 目前常用的保护剂为二甲亚砜 DMSO 和甘油 它们对细胞无毒性 分子量小 溶解度大 易穿透细胞 18 培养细胞技术 预先配制冻存液 培养基 20 血清 10 DMSO取对数生长期细胞 经胰酶消化后 加入适量冻存液 用吸管吹打制成细胞悬液 1 106 5 106细胞 ml 标
8、记冷冻细胞名称和冷冻日期 加入1ml细胞于冻存管中 立即密封后放入冻存盒 或 20 C冰箱 然后放入 80 C冰箱 最后放入液氮 细胞冻存方法 19 培养细胞技术 3 细胞复苏 细胞复苏时速度要快 使之迅速通过细胞最易受损的 5 0 细胞仍能生长 活力受损不大 1 从液氮中取出冷冻管 迅速投入37 38 水浴中 使其融化 1 2分钟左右 2 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 3 低速离心10分钟 4 去上清 加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 20 细胞培养过程中常见的问题 1 培养液pH值快速偏离 CO2浓度异常 培养瓶盖过紧 细菌 酵母或霉菌污染 2 培养液出现沉淀 细菌或霉菌污染 3
9、细胞不贴壁 胰酶过度消化细胞 支原体污染 缺乏附着因子 4 细胞死亡 孵箱中缺CO2 孵箱温度不稳定 细胞冻融损伤 渗透压改变 培养液中毒性代谢产物堆积 5 细胞生长缓慢 培养液或血清改变 基本促生长成分的消耗 缺乏或降解 如谷氨酰胺 生长因子等 低水平的细菌或霉菌污染 接种细胞数太少 有限培养细胞衰老 支原体污染 21 细胞培养过程中常见的问题 22 支原体污染及判断支原体 mycoplasma 是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物 直径0 22 m左右 无细胞壁 对理化因素比较敏感 受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现 培养液也不浑浊 部分敏感细胞生长增殖变慢 细胞变圆 脱落 在细
10、胞培养过程中 如在显微镜下发现破碎的细胞有许多 培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时 应怀疑培养物可能受支原体污染 支原体可通过培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链式反应 免疫学等方法进行检测 细胞培养过程中常见的问题 23 污染的排除一般的原则是应将污染的细胞弃去 而不要试图去除污染 非常重要的细胞株才考虑去除污染 但在任何情况下 污染都很难完全被消除 细菌污染的排除 可使用大剂量抗生素冲击法 向污染的细胞培养液中加入大剂量的抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗生素 一般采用5 10倍于常用量进行用药 加入高浓度抗生素后作用24 48小时 再换入常规的培养液 有时可以奏效 支原体的排除 卡那霉素 庆大霉素 支原体去除因子 MRA 等对抗支原体是有活性的 可使用它们抑制或消除支原体 细胞培养过程中常见的问题 24 谢谢 25
