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1、第三章核酸操作的基本技术 3 1碱抽提法提取DNA 碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法 是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法 是当今分子生物学研究中的常规方法 碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的 在pH值达到12 6的碱性条件下 染色体DNA的氢键断裂 双螺旋结构解开而变性 质粒DNA的大部分氢键也断裂 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离 当以pH4 8的NaAc高盐缓冲液调节其Ph至中性时 变性的质粒 又恢复原来的构型 保存在溶液中 而染色体 不能复性 而形成缠连的网状结构 通过离心 染色体 与不稳定的大分子 蛋白质 复合物等一起沉淀下来而
2、被除去 碱变性抽提质粒 除了菌体培养 质粒扩增和收集菌体外 其提取过程大体分为三个步骤 从染色体 中分离质粒 去除质粒 中的 进一步纯化质粒 去除蛋白质等杂质 3 1 1碱抽提法所用各类试剂的生化作用 溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 糖苷键 因而具有溶菌作用 NaOH SDS液 核酸在pH 的溶液中是稳定的 但当pH 或pH 时 就会引起双链之间氢键的解离而变性 是离子型表面活性剂 它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 解聚 细胞中的核蛋白 还能与蛋白质结合成为 R 蛋白质的复合物 使蛋白质变性而沉淀下来 但是 能抑制核糖核酸酶的作
3、用 所以在以后的提取过程中 必须把它去除干净 防止它影响Raase的活性 a c的水溶液呈碱性 为了调节pH至4 8 必须加入大量的冰醋酸 目的是把pH12 6的抽提液调节至中性 使变性的质粒 能够复性 并能稳定存在 而高盐的 mol LNaAc有利于变性的大分子染色体 以及 蛋白复合物的凝聚而沉淀之 乙醇 溶液是 以水合状态稳定存在 当加入乙醇时 乙醇会夺去 周围的水分子 失水而易于聚合 一般实验中 是加 倍体积的无水乙醇与 相聚合 其乙醇的最终含量占 左右 缓冲液 在基因操作实验中 选择缓冲液的主要原则是考虑 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用 采用Tris HCL的缓冲系统 由于缓冲液是
4、TrisH Tris 不存在金属离子的干扰作用 故在提取或保存 时 大都采用Tris HCL系统 而 缓冲液中的 更能稳定 的活性 酚 氯仿 酚与氯仿是非极性分子 水是极性分子 当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时 蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去 使蛋白质失去水合状态而变性 经过离心 变性蛋白质的密度比水的密度大 因而与水相分离 沉淀在水相下面 从而与溶解在水相中的 分开 而酚与氯仿有机溶剂比重更大 保留在最下层 异戊醇 在抽提 时 为了混合均匀 必须剧烈振荡容器数次 这时在混合液内易产生气泡 气泡会阻止分子相互间的充分作用 加入异戊醇能降低分子表面张力 所以能减少抽提过程中泡沫的产生 一般采
5、用氯仿与异戊醇之比为 也可采用酚 氯仿与异戊醇之比为 同时异戊醇有助于分相 使离心后的上层水相 中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定 饱和酚 因为酚与水有一定的互溶 苯酚用水饱和的目的是使其抽提 过程中 不致吸收样品中含有 的水分 减少 的损失 用 ris调节pH为 是因为 在此条件下比较稳定 质粒DNA的小规模提取 碱裂解法1 接种一单菌落于3ml含70 l mlAmp的LB液体培养基中 200转 分37 振荡培养过夜 约8 10h 12000rpm离心1min收集细菌 2 用STE重悬细菌沉淀 12000rpm离心5min 弃上清 3 将细菌沉淀重悬于100 l冰预冷的溶液I中 加入2
6、00 l新配制的溶液II 温和转动使之混匀 冰浴2min 4 加入150 l溶液III 将管倒置摇荡1min 冰浴5min 质粒DNA提取溶液 50mM葡萄糖 25mMTris Cl pH8 0 10mMEDTA pH8 0 高压灭菌 4 保存 质粒DNA提取溶液 0 2MNaOH 1 SDS 现配现用 质粒DNA提取溶液 5M乙酸钾溶液60ml 冰乙酸11 5ml 灭菌水28 5ml 5 12000rpm离心8min 小心取上清于离心管中 加等体积酚 氯仿抽提一次 6 取上清液加入1 5体积5M的乙酸胺 再加入2倍体积无水乙醇 12000rpm离心5min 弃上清 加入70 乙醇沉淀 7 离
7、心弃上清 真空抽干 去除痕量乙醇 8 加入50 lTE并加入1 lRNase放入37 水浴1h 9 0 7 琼脂糖电泳检测其含量 3 1 2碱抽提法抽提DNA过程中应注意的问题 1 染色体DNA 蛋白质与RNA是否去除干净 是否获得一定得率的质粒DNA 2 所用器皿必须严格清洗 各种试剂配制是否准确 有的需高压高温灭菌 3 加乙醇沉淀DNA时 要把离心管加盖摇动4 5次 注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后 才可以放入冰箱中沉淀DNA 3 2DNA提取的其他方法 2 2 1质粒DNA的分离纯化2 2 1 1微量提取质粒 小规模制备质粒 的特点是可以一次制备多种质粒 速度快 省时间 步骤简化
8、纯度好 可以用于酶切 连接 甚至多纯化几次还可作双链 序列分析的模板等常规基因工程操作之用 主要有下列方法 有煮沸法 孔微量滴定板法 碱变性 和和 法 单链质粒 的小量制备法 不需要苯酚抽提的质粒 的小量制备和用商品化试剂盒制备质粒 等 3 2 1质粒 的大量制备 在制作酶谱 测定序列 制备探针等实验中需要高纯度 高浓度的质粒 为此需要大量提取质粒 大量提取的质粒 一般需进一步纯化 常用柱层析法和氯化铯梯度离心法 的抽提方法主要有 煮沸裂解法 裂解法 Triton裂解法和Wizard大量 纯化系统等 质粒DNA的大量制备1 接种含有目的片段的单菌落于100ml液体LB培养基中 37 培养过夜
9、4000rpm 4 离心10min 收集菌体 2 将细菌沉淀用20ml冰预冷的STE溶液重悬 按上述方法重新离心 去上清 倒置 用吸水纸吸干残留液 加入冰预冷溶液 2ml 将细菌沉淀重悬 3 加200 l新配制的溶菌酶溶液 10mg ml溶于10mMTris Cl pH8 0 混匀 4 加入4ml新配制的溶液 缓慢颠倒数次 充分混匀内容物 于室温放置5 10min 5 加2ml用冰预冷的溶液 将离心管颠倒数次 冰浴15min 12000rpm 4 离心20min 6 将上清转移至另一离心管中 加0 6倍体积异丙醇 充分混匀 于室温放置10min 10000rpm 室温离心15min 回收质粒沉
10、淀 7 去除上清 用70 乙醇洗沉淀一次 稍抽干 溶于1mlTE中 8 加入5 lRNaseA 5mg ml 37 消化1hr 9 转移至小离心管 用等体积的苯酚 苯酚 氯仿 氯仿 各抽提一次 10 加入1 5体积的10MNH4AC 再加入2倍体积的无水乙醇 混匀 室温放置30min 12000rpm 室温离心10min 11 弃上清 70 乙醇洗沉淀两次 真空抽干 溶于适量TE中 储存于 20 3 2 2质粒 的纯化 聚乙二醇沉淀法纯化质粒 氯化铯 溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环 从质粒 制品中去除 通过 mol LNaCl进行离心 通过Bio GelA 150m或SepharoseCL 4
11、B进行层析 3 2 3基因组或其他 的抽提 2 2 2 1细菌基因组 的制备以微量制备法为例 ml细菌培养液生长至对数生长期 取1 5ml转入小离心管中离心 min 2 用567ul 缓冲液重新悬浮沉淀 加入30ul的 的 和3ul的20mg ml蛋白酶 混合 在 下保温 h 加入100ul的 mol LNaCl 完全混合 再加入80ulCTAB NaCl溶液 混合 在65 下保温10min CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 加入等体积的酚 氯仿 异戊醇 混合 离心 min 将上清液转移至一新的离心管中 按上述步骤重复抽提 将上清液转移至一新的离心管中 加入0 6倍体积的异丙醇 轻轻混合直至 沉
12、淀 用70 乙醇洗一下沉淀 离心 min 弃去上清液后真空干燥 用100ul 缓冲液重新悬浮 3 2 4哺乳动物细胞基因组 的抽提 哺乳动物基因组DNA通常先用SDS等裂解 再用苯酚抽提进行分离 用这类方法产生的DNA长度 100 150kb 适用于Southern分析和用 噬菌体构建基因组文库 1 哺乳动物组织细胞的DNA提取组织样保存在70 乙醇中 20 冻存 提取 时组织样需研碎 乙醇挥发掉 提取方法同质粒的 提取法 2 哺乳动物血液基因组DNA的提取 1 取750ul冻存血加入等量PBS 混合均匀 2 12000rpm离心5分钟 弃上清 3 加入450ulDNA提取buffer 重悬沉
13、淀 4 加入Rnase至终浓度20ug ml 37 温育1小时 5 加入蛋白酶K至终浓度100ug ml 混匀 55 水浴消化过夜 6 加入等体积 ris饱合酚 温和摇动10分钟 12000rpm离心 分钟 7 将上层水相转移至另一干净离心管 8 再加入等体积酚 氯仿和氯仿 各抽提一次 9 上层水相用1 5体积乙酸钠和 倍体积无水乙醇沉淀 10 12000rpm离心10分钟 收集沉淀 70 乙醇洗沉淀 11 真空抽干 用适量TE pH8 0 溶解 2 2 5从植物中分离基因组DNA 从植物中分离高产量和高质量DNA不是一件容易的事 由于细胞壁及植物特有的细胞内物质 需要用较特殊的处理方法 1
14、用CTAB抽提植物DNA 1 将组织放入离心管中 加入5倍体积的抽提缓冲液 再加入一些洗过的灭菌海沙于 20 冷冻 2 用杵将组织压软 置组织于液氮中磨碎 3 短暂振荡 于65 温浴5min 4 加1倍体积的氯仿 异戊醇混合物 轻轻颠倒几次使之混匀 离心5min 将上层水相转移到另一管中 5 加1倍体积的溴化乙锭液 1倍体积苯酚和1倍体积氯仿 轻轻混匀 离心取上清 溴化乙锭可帮助除去多糖 大多数植物组织可省去这一步 6 加1 10体积的3mol L醋酸钠和1倍体积异丙醇 于 20 放置30min或过夜 沉淀DNA 7 以12000r min离心10min 倒掉上清 8 加0 5ml冷的70 乙
15、醇 重悬沉淀 离心2min 9 真空或37 放置10min 干燥DNA 10 适量TE溶解DNA 3 3DNA的定量和纯度测定 对于基因操作中的载体DNA和外源目的DNA片段 必须对其浓度 纯度 构型 相对分子量大小等基本情况进行了解 有时DNA中含有酚类和多糖类物质会影响酶切和PCR的效果 尤其DNA浓度是一个非常关键的因素 3 3 1紫外光谱分析法紫外光谱分析法的原理基于DNA RNA 分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比 该法的特点是准确 简便 但所需仪器较昂贵 由于测定OD260时 难以排除RNA 染色体DNA 以及解链的增色效应的因素 因此
16、测得的数据往往比实际浓度偏高 衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值 OD260 OD280对DNA而言其值大约为1 8 高于1 8则可能有RNA污染 低于1 8则有蛋白质的污染 在260nm的读数用于计算样品中核酸的浓度 OD值为1相当于大约50ug ml双链DNA 40ug ml单链DNA或RNA以及大约20ug ml的单链寡核苷酸 EB荧光分析法EB 溴化乙锭 一种荧光染料 它能插入DNA或RNA的碱基对平面之间而结合于其上 一旦EB结合在DNA分子上 它能在紫外光的激发下产生桔黄色荧光 这种方法的优点是简便易行 经济 并且与凝胶电泳相结合可以分析DNA样品是否完整等 缺点是准确性较低
